Рентгеноструктурный анализ, исследование механизмов действия ферментов

Таким образом, в понимании механизма реакции, катализируемой рибонуклеазой, достигнуты огромные успехи. На примере этого фермента мы дали лишь краткий обзор разнообразных методов, которые следует использовать при изучении механизма действия ферментов, однако большое число важных исследований здесь не рассматривалось. При этом необходимо отметить, что исследования с помощью физических методов (кинетика, рентгеноструктурный анализ и т.д.) хотя и дают очень ценную информацию, не всегда способны ответить на многие из возникающих вопросов. Естественно, что наилучшего понимания механизма действия ферментов достигают только при совокупном использовании данных, полученных как физико-химическими, так и любыми другими методами. Это хорошо показано на примере исследования рибонуклеазы. [c.81]

Для каждого класса субстратов (3, 5 -динуклеотид, 2, 3 циклофосфат, 3 -нуклеотид) реакция включает бимолекулярную стадию образования первичного комплекса (стадии 1,1 , 1 "), за которой следует его изомеризация (стадии 2,2, 2"). Кроме того, исследование свободного фермента показало, что фермент существует в двух конформациях (стадия 3). Эти кинетические результаты были сопоставлены с данными рентгеноструктурного анализа, что позволило постулировать детальный механизм действия фермента. [c.185]

Успехи, достигнутые в области рентгеноструктурного анализа, кинетики переходных процессов и химического катализа за последние 20 лет, в корне изменили наши представления о ферментативном катализе и механизме действия ферментов. Данная монография представляет собой краткий обзор последних достижений в этой сфере и адресована студентам и аспирантам, уже прослушавшим соответствующие курсы по химии и биохимии. В книге в теоретическом и методологическом аспектах рассматриваются два вопроса природа взаимодействия между ферментом и его субстратами, обусловливающего ферментативный катализ и специфичность действия фермента, и взаимосвязь между структурой фермента и механизмом ферментативного процесса. Обсуждаются экспериментальные подходы, позволяющие проводить прямые исследования ферментов на молекулярном уровне. Большое внимание уделяется, например, исследованию ферментативных реакций в предстационарных условиях, когда ферменты используются в концентрациях, сопоставимых с концентрациями субстратов, и можно непосредственно наблюдать за промежуточными фермент-содержащими соединениями. Кратко освещены проблемы взаимодействия ферментов с несколькими субстратами в стационарных условиях, а также некоторые вопросы химии коферментов и кофакторов. [c.9]

HIV-1. Практически эта задача оказалась чрезвычайно сложной и на сегодняшний день нерешенной Среди требований, предъявляемых к свойствам ингибиторов, главное и самое трудновыполнимое касается избирательности их действия. Ингибиторы, обладающие терапевтическим эффектом, должны быть прежде всего высокоспецифичны до такой степени, чтобы дезактивируя ретровирусную протеиназу, не нарушать нормального функционирования как аспартатных, так и других протеолитических ферментов клетки-хозяина. Для целенаправленного поиска ингибиторов, удовлетворяющих этому требованию, необходимо располагать количественными данными о всех стадиях катализа вирусной протеиназы и механизмах функционирования протеиназ инфицированной клетки, а также владеть методом решения обратной структурной задачи, те конструирования химического строения ингибитора по заданной пространственной форме. Вероятность обнаружения таких ингибиторов экспериментальным или эмпирическим путем мала. Помимо того, что этот путь ненадежен, он чрезвычайно дорогостоящ и продолжителен На несовершенство используемого подхода, допускающего исследование только в направлении от функции к структуре, указывают разработанные схемы катализа аспартатных протеиназ. Они интересны в том отношении, что исходят по существу из одного и того же экспериментального материала, включающего данные рентгеноструктурного анализа и результаты многочисленных биофизических и биохимических исследований, а также базируются на одинаковых традиционных, теоретических представлениях о природе биокатализа. При единстве исходного опытного материала, теоретической основы и в рамках одного подхода были предложены пять различных стереохимических моделей функционирования аспартатных протеиназ, которых, впрочем, могло быть и больше [363-366]. [c.546]

Понять суть этого удивительного процесса активации можно, лишь зная в деталях структуру и механизм каталитического действия химотрипсина. К счастью, фермент этот исследован достаточно хорошо методами химического и рентгеноструктурного анализа. По существу химотрипсин - это один из самых изученных ферментов, и поэтому имеет смысл рассмотреть его более детально. [c.153]

Раскрытие с помощью метода рентгеноструктурного анализа пространственного строения ряда ферментов явилось надежной основой для построения рациональных схем механизма их действия. В одних случаях эти схемы основываются почти целиком на анализе структуры фермент-субстратных комплексов а кристалле, а в других — используются также результаты исследований по химической модификации ферментоа, кинетике катализируемых реакций и другие данные. Установление механизма действия ферментоа имеет ключевое значение для раскрытия структурно-функциональных взаимосаязей во множестве биологически актианых систем. В данном разделе приведены сведения о механизме действия ряда ферментов они могут служить иллюстрацией используемых подходов. [c.188]

Одним из наиболее исследованных семейств ферментов являются сери-нопротеазы. Все они предназначены для расщепления полипептидньгх цепей белков по механизму, в котором участвует боковая цепь аминокислоты серина (— Hj—ОН), находящейся в активном центре фермента. Три такие протеазы (трипсин, эластаза и химотрипсин) синтезируются в поджелудочной железе и вьщеляются ею в кишечник, где они превращают содержащиеся в пище белки в аминокислоты, способные всасываться через стенки кишечника. Благодаря возможности легко изолировать эти ферменты и их сравнительно высокой устойчивости их удалось интенсивно исследовать химическими способами еще до того, как стало возможным проведение рентгеноструктурного анализа белков. В настоящее время биохимический и рентгеноструктурный анализы позволили установить достаточно ясную картину функции этих ферментов, иллюстрирующую два аспекта действия любых ферментов каталитический механизм и специфичность к субстрату. [c.318]

Рентгеноструктурный анализ лизоцима белка курнных яиц, завершенный в 1965 г. (см. [5]), и соответствующие выводы о механизме его действия стимулировали работу многих исследователей в различных странах мира ио изучению структуры лизоцима из других источников. В основе этих работ было предположение, что вариации в структуре активных центров лизоцимов различного происхождения помогут выявить общие закономерности для всех лизоцимов, играюнхие главную роль в катализе данными ферментами. Помимо этого, такие исследования, возможно, позволили бы найти структурные факторы, из-за которых лизоцимы из разных источников имеют различное каталитическое поведение ([4], с. 4). [c.139]

Недавние исследования динамики молекулы лизоцима с помощью кристаллографических методов показали [55, 56], что атомные смещения в белке наиболее выражены в области активного центра фермента. Хотя эти исследования иока носят лишь постановочный характер, не исключено, что в будущем применение рентгеноструктурного анализа именно для изучения динамических свойств молекул белка (определение средних амплитуд смещения каждого атома от его усреднеппой позиции в кристалле), помимо зарекомендовавших себя исследований статических свойств белковых молекул в кристалле (оиределение усредненных координат всех атомов в молекуле на основе соответствующего распределения электронных плотностей), может дать важную и принципиально новую информацию о структуре ферментов н механизмах их действия. Далее, обещающими являются новые возможности прямого рентгеиоструктурного анализа промежуточных состояний в ферментативном катализе путем охлаждения кристаллов фер-мент-субстратного комплекса в подходящих водноорганических растворителях и определепия структуры образующихся молекулярных комплексов непосредственно в ходе реакции [57, 58]. Этот [c.158]

Чтобы на основании всего сказанного не создалось впечатления, будто коферменты представляют собой особый род субстратов, отличающийся от остальных какими-то иными свойствами помимо того, что они крайне удобны для изучения фермент-субстратных комплексов, следует отметить, что имеются также и другие убедительные примеры образования этих промежуточных продуктов. Например, сопоставление данных рентгеноструктурного анализа с разрешением 2—3 А для карбокси-пептидазы А и ее комплекса с глицил-Ь-тирозином [38] показывает не только истинное расположение связанного пептида в гидрофобном кармане фермента, но и такие тонкие детали, как сдвиг остатка тирозина на 14 А по направлению к субстрату при образовании комплекса. Впечатляющим примером подобного исследования является рентгеноструктурный анализ лизоци-ма [39], коррелирующий с результатами изучения механизма его действия [40]. Здесь, как и в случае карбокси-пептидазы, структура свободного фермента и его комплекса исследована очень детально. [c.62]

На основании данных, полученных с помощью рентгеноструктурного анализа и при исследовании свойств РНазы в растворе, предложено несколько схем механизма действия этого фермента одна из них приведена на рис. 9.10. Данная схема не может считаться однозначно доказанной однако ясно, что в случае катализа РНазой увеличение скорости реакции обусловлено специфическим связыванием различных групп субстрата соответствующими участками активного центра и, вероятно, согласованным действием His-12 и His-119, осуществляющим общий кислотно-основной катализ. [c.313]

Лизоцим в зависимости от условий кристаллизуется с образованием ряда полиморфных форм — тетрагональной, триклииной, моноклинной, орторомбической [29, 30]. Наиболее известна тетрагональная структура, с использованием которой и было получено большинство рентгеноструктурных данных. По мнению самого Филлипса [5], тетрагональная структура кристаллического лизоцима имеет один серьезный недостаток — молекулы фермента в ней подходят друг к другу особенно плотно и взаимодействуют в области участков Е и Р активного центра, что не позволяет наблюдать связывание сахаров с данными участками без разрушения кристаллов. Это, видимо, стимулировало изучение других кристаллических форм лизоцима [29—31], хотя и без особого успеха в выявлении новых деталей строения активного центра и механизма его действия. Более того, выяснилось, что триклигшый лизоцим еще менее пригоден в данном отношении для исследований, поскольку у него в кристаллической ячейке взаимно блокированы три участка активного центра — О, Е и Е [32, 33]. По предварительным данным, моноклинная и орторомбическая формы кристаллического лизоцима страдают тем же недостатком [34, 34а]. В настоян ее время надежды возлагаются на лизоцимы из других источников, такие как лизоцим из белка яиц черепахи [34], четвертичная структура которого практически идентична лизоциму из белка куриных яиц, но кристаллы содержат аномально большое количество воды. Возможно, и этом случае активный центр фермента будет более доступен для аналогов субстрата и эффекторов и соответствующий рснгеноструктурный анализ приведет к более определенным выводам о топографии связывающих участков активного центра. [c.154]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология