Световая микроскопия фазово-контрастная

Рис. 4-10 Фибробласт в культуре ткани при наблюдении с помощью четырех различных типов световой микроскопии. А. Изображение получено при прямом прохождении лучей через клетку (микроскопия в светлом поле). Остальные изображения получены с помощью методов, рассматриваемых в тексте Б-фазово-контрастная микроскопия В -интерференционная микроскопия /" микроскопия в темном поле Простая замена

Рис. 4-9. Два способа увеличения контраста в световой микроскопии. А. Окрашенные участки клетки уменьшают амплитуду проходяш,их световых волн определенной длины В результате можно получить окрашенное изображение, видимое при прямом наблюдении Б. Амплитуда световых волн, проходяш,их через неокрашенную живую клетку, практически не меняется поэтому многие детали нельзя увидеть при прямом наблюдении. Здесь, однако, имеет место изменение фазы проходяш,его света явление, используемое в фазово-контрастном и интерференционном микроскопах

Для проведения исследований необходимо в дополнение к световому микроскопу иметь фазово-контрастное устройство (в настоящее время наиболее широко применяется модель КФ-4), которое состоит из фазовых объективов (на оправе имеется буква Ф ), конденсоров с набором кольцевых диафрагм и вспомогательного микроскопа (оптического устройства, помещаемого в тубус вместо окуляра при установке фазового контраста). [c.18]

Фазово-контрастная микроскопия. Известно, что оптическая длина пути света в любом веществе зависит от показателя преломления. Световые волны, проходящие через оптически более плотные участки объекта, отстают по фазе от волн, не проходящих через эти участки. При этом интенсивность света не меняется, а изменяется только фаза колебания, не улавливаемая глазом и фотопластинкой. Для повышения контрастности изображения в объектив микроскопа вкладывают специальную полупрозрачную фазовую пластинку, в результате чего между лучами фона и объекта возникает разность амплитуд световых волн. Если она достигает /4 длины волны, то возникает заметный для глаза эффект, когда темный объект отчетливо виден на светлом фоне (положительный контраст), или наоборот (отрицательный контраст), в зависимости от структуры фазовой пластинки. [c.9]

Одно из преимуществ фазово-контрастной микроскопии перед темнопольной, которая применяется в настоящее время реже, заключается в полном использовании апертуры объектива, что влечет за собой необходимость применения самых высококачественных фазово-контрастных объективов. Это в свою очередь предполагает использование конденсора с достаточно большой апертурой и, так же как и раньше, применение компенсационных окуляров с увеличением 15х или даже 20X, способных реализовать то высокое разрешение, которое дают объективы. Вполне доступны фазово-контрастные иммерсионные объективы средней силы (40Х—бОХ), которые дают хорошо очерченные полноценные изображения при работе с мицелием грибов и другими большими клетками. Наилучшие результаты получают, применяя объективы с увеличением 90Х и ЮОХ и числовой апертурой больше 1,0, используя иммерсию. Однако удовлетворительные результаты фазово-контрастная микроскопия дает и без применения иммерсии, например при подсчете бактерий, простейших и спор, проверке подвижности или при определении размера и формы. В том случае, когда хотят увидеть детальную внутриклеточную организацию живых организмов, следует обратить внимание на преломляющие свойства среды, в которой рассматриваются клетки наилучших результатов достигают при добавлении в среду желатины до 15—30%. При этом показатели преломления среды и внутриклеточного содержимого становятся одинаковыми или почти одинаковыми, а фазовая задержка пропорциональна показателю преломления, умноженному на световой путь. В этих условиях уменьшаются также ореолы. [c.23]

Первые сведения об общей организации и тонкой структуре клетки были получены с помощью оптических методов. По мере совершенствования оптических приборов и улучшения техники микроскопирования росли и наши знания о микроморфологии клетки и ее отдельных компонентов. Дальнейшее развитие световой микроскопии, а также ультрафиолетовой и электронной микроскопии позволило существенно повысить разрешающую способность оптических приборов темнопольная и фазово контрастная микроскопия облегчила наблюдение живой клетки. Несомненно, и поныне микроскопия, особенно электронная, в сочетании %о сложной предварительной обработкой биологического материала остается важнейшим методом исследования. Для получения дополнительных сведений о молекулярном уровне приходится прибегать к косвенным физическим и химическим методам, с помощью которых стало возможным вьщелять и исследовать отдельные клеточные компоненТ1Е% [c.22]

Спирохеты не прокрашиваются удовлетворительно обычными красителями, хотя свободноживущие спирохеты хорошо видны в нигрозиновых пленках. Размеры (толщина) многих из них находятся на пределе разрешения светового микроскопа. Обычно эти бактерии наблюдают живыми с помощью прямой темнопольной или фазово-контрастной микроскопии. Полезно знать, что в пленках, окрашенных по Гимзе, спирохеты флуоресцируют ярким золотисто-желтым светом при просмотре с темнопольным освещением. [c.83]

В световом, а также в фазово-контрастном микроскопах ядро обычно представляется оптически гомогенным видны лишь обо- [c.68]

Изучение морфологии и строения клеток микроорганизмов, величина которых измеряется в большинстве случаев микрометрами (мкм=0,001 мм=10 м), возможно только с помощью микроскопов, обеспечивающих увеличение исследуемых объектов в сотни (световая микроскопия) и десятки тысяч (электронная микроскопия) раз. Изображение в световом микроскопе формируется вследствие того, что объект и различные элементы его структуры избирательно поглощают свет с различной длиной волны (абсорбционный контраст) или вследствие изменения фазы световой волны при прохождении света через объект (фазовый контраст). Световая микроскопия включает обычную просвечивающую микроскопию (светло- и темнопольную), фазово-контрастную и люминесцентную. [c.81]

Вакуоли с клеточным соком становятся более заметными благодаря прижизненной окраске слабым раствором нейтрального красного. Пульсирующие вакуоли можно наблюдать на живом материале в световом микроскопе благодаря их периодическому наполнению и опорожнению. Применение фазово-контрастного устрой [c.23]

Казалось бы естественным изучение фазового состава основывать главным образом на исследовании микроструктуры смеси полимеров. Прямое исследование микроструктуры в световом (фазово-контрастном) или электронном микроскопе при современных методах подготовки образцов дает интересную информацию о структуре смеси [2, 3, 77, 78, 80, 84, 85, 88—90, 155 165 и др.]. Этот метод дает также информацию, которую вообще нельзя получить другими методами. Но метод имеет и свои недостатки, самый основной из которых обусловлен высокомолекулярной природой полимеров. Если в смеси полимеров размер частиц дисперсной фазы составляет, например, 100— 150 А, то это могут быть либо действительно частицы второй фазы, либо такие микронеоднородности, которые свойствами фазы не обладают. Действительно, одна макромолекула, свернутая на себя, имеет размер указанного порядка. Если полимеры совместимы и произошло диспергирование до отдельных макромолекул, то под микроскопом такие макромолекулы могут выглядеть как частицы второй фазы, даже если произошло самопроизвольное растворение одного полимера в другом. В истинных растворах низкомолекулярных веществ обычно происходит ассоциация однородных молекул. Если макромолекулы образуют ассоциат еще до возникновения новой фазы, то он может иметь размеры обычных коллоидных-частиц. Поэтому наличие микронеоднородности, видимой в микроскоп, не есть еще однозначное подтверждение наличия двухфазной структуры система двухфазна тогда, когда свойства частички идентичны свойствам большого объема материала дисперсной фазы. В сущности такой подход следует из определения Гиббса. Так, в книге Киреева ([166], стр. 232) сказано Фаза — совокупность всех гомогенных частей системы, одинаковых по составу и по всем химическим и физическим свойствам (не зависящим от количества вещества) и отграниченных от других частей системы некоторой поверхностью (поверхностью раздела) . [c.35]

Основываясь на информации, полученной с помощью световой, фазово-контрастной и электронной микроскопии, гистохимических и цитохимических методов, а также при разрушении и разделении клеток на фракции (разд. 11.4.2.2), и сопоставляя ее с результатами физических и химических исследований субклеточных компонентов, удалось достичь более глубокого понимания специфических функций, которые выполняют в жизни клетки субклеточные органеллы. На рис. 11.4 представлена электронная микрофотография главных органелл гепатоцита крысы. [c.368]

Фазово-контрастная микроскопия. Известно, что оптическая длина пути света в любом веществе зависит от показателя преломления. Световые волны, проходящие через оптически более плотные участки объекта, отстают по фазе от волн, не проходящих через эти участки. При этом интенсивность света не меняется, а изменяется только фаза колебания, не улавливаемая глазом и фотопластинкой. Для повышения контрастности изображения в объектив микроскопа вкладывают специальную полупрозрачную фазовую пластинку, в результате чего между лучами фона и объекта возникает разность амплитуд световых волн. Если она достигает [c.9]

В передней фокальной плоскости конденсора 3 вместо апертурной диафрагмы устанавливается кольцеобразная диафрагма 4, которая конденсором и объективом изображается в задней фокальной плоскости объектива 2. Здесь помещена фазовая пластинка 1, представляющая собою фазовое кольцо, нанесенное на поверхности линзы вблизи заднего фокуса объектива. Это кольцо поглощает значительную часть света, прямо прошедшего через препарат, и сдвигает его фазу, т. е. обусловливает запаздывание (негативный контраст) или опережение (позитивный контраст) во времени на четверть длины световой волны Ч к). Свет, рассеянный, диафрагмированный, препаратом (пунктирные линии), проходит мимо фазового кольца и не претерпевает дополнительного сдвига фазы. Таким образом фазово-контрастное устройство ослабляет интенсивность и задерживает яркий нулевой дифракционный спектр, не внося каких-либо изменений в остальные спектры, благодаря чему в неокрашенных прозрачных объектах становится хорошо видна их структура. Темные и светлые места в фазово-контрастном изображении соответствуют различной толщине или оптической плотности препарата. Для преобразования невидимого фазового изображения препарата в обычное видимое изображение применяются фазовоконтрастное приспособление КФ-4 и фазовотемнопольное приспособление МФА-2, которые устанавливают на микроскопах вместо обычного конденсора. [c.37]

В отличие от фазового контраста в интерференционном микроскопе л<ивая клетка может иметь вид окрашенного препарата вследствие того, что на вторичное изображение объекта накладывается дополнительная световая волна, от взаимодействия с которой получается контрастное или цветное изображение. [c.44]

Качество ядерных препаратов оценивается па основании следующих критериев 1) морфологические особенности при наблюдении в обычном световом микроскопе, фазово-контрастном микроскопе и электронном микроскопе 2) наличие таких ферментов, как НАД-пирофосфорилаза (К. Ф., 2.7.7.1), которые встречаются исключительно в ядрах 3) отсутствие цитоплазматических ферментов, например цитохромоксидазы (К. Ф., 1.9.3.1) или глюкозо-6-фосфатазы (К. Ф., 3.1.3.9). [c.137]

Фазово-контрастная микроскопия. Основана на превращени изменений по фазе, возникающих при прохождении светово) волны через так называемые фазовые (прозрачные) объекты в изменения по амплитуде, которые улавливаются глазом С помощью фазово-контрастного приспособления фазовы изменения световых волн, проходящих через объект, превра щаются в амплитудные и прозрачные (Объекты становятс видимыми в микроскоп. При этом они приобретают высокую контрастность изображения, которая может быть позитивно или негативной. Позитивным фазовым контрастом называю темное изображение объекта в светлом поле зрения негатш [c.13]

Микоплазмы, вероятно, представляют собой самые маленькие бактерии, которые можно наблюдать в световой микроскоп и которые с трудом поддаются индивидуальному распознаванию из-за сильно выраженного плеоморфизма. Характерные колонии микоплазм, имеющие вид яичницы-глазуньи, наблюдают при прямой микроскопии чашек с агаром. Для анализа колоний полезен подход, разработанный Динесом и заключающийся в том, что препараты смотрят после того, как на место роста бактерий наносят каплю метиленового синего и накрывают ее покровным стеклом. В случае объектов, близких по размерам к пределам разрешения, оптические измерения при фазово-контрастной микроскопии затруднены по двум причинам. Первая — это ореольные артефакты и вторая — присущие фазовому контрасту особенности формирования изображения, благодаря которым круглые объекты выглядят меньше, чем они есть на самом деле. В морфологических исследованиях и при изучении подвижности микоплазм применяются влажные препараты. Что же касается типа микроскопирования, то рекомендуются методы фазового контраста и темнопольного освещения. Если нужны окрашенные препараты микоплазм, то предпочтительнее использовать несколько модифицированную методику окраски по Гь м-зе (см. ниже), которую следует применять к предварительно фиксированным организмам. Фиксировать микоплазмы лучше раствором Боуэна (разд. 2.2.1) непосредственно в слое агара, лежащем на покровном стекле. [c.84]

Отдельный бактериальный жгутик настолько тонок, что неразличим в световом микроскопе, если он не окрашен особым способом, который увеличивает кажущуюся толщину жгутика. Так, диаметр отдельных жгутиков колеблется в пределах 0,01 — 0,02 мкм (у Bdellovibrio 0,04—0,06 мкм), а максимальное разрешение светового микроскопа составляет 0,2 мкм. Лишь у немногих бактерий, например у представителей рода Spirillum, пучки жгутиков достаточно плотны и их удается обнаружить при наблюдении в светлом поле с помощью фазово-контрастного устройства или в темном поле. [c.106]

При разрушении клеток любым способом должна контролироваться степень разрушения. Часто с этой целью подсчитывают относительное число выживших клеток, но, видимо, это не лучший способ контроля, так как клетки могут утратить жизнеспособность и без потери внутриклеточного содержимого. Хорошим способом контроля является световая микроскопия влажных препаратов, но только в том случае, если она осуществляется количественно путем подсчета относительного числа оставшихся интактными клеток в счетной камере какого-либо типа. Это необходимо потому, что иногда при разрушении клеток образуются субклеточные фрагменты, которые слишком малы, чтобы их можно было различить в световом микроскопе. Чтобы отличать интакт-ные клетки от лишенных содержимого теней или больших фрагментов клеточной оболочки, применяют фазово-контрастную микроскопию, а также негативную окраску нигрозином или тушью. Если клетки разрушают по методике, в соответствии с которой они переходят в сферопласты или протопласты в осмотически стабилизированной среде, важно определить процент такого перехода при этом лучше воспользоваться счетной камерой, чем просто просматривать влажные препараты. Ли-зированные протопласты или сферопласты часто плохо видны в световой микроскоп, и одного лишь качественного сравнения числа этих структур, оставшихся интактными, с числом нормальных клеток недостаточно. [c.139]

Эффективность обработки следует контролировать с помощью светового микроскопа, отбирая кончиком микропипетки на предметное стекло небольшое количество жидкости. Используйте увеличение 400х или больше. В ряде случаев возможна недооценка результатов обработки, поскольку дрожжевые клетки могут внешне сохранять морфологическую целостность, несмотря иа то что клеточная стенка разрушена и содержимое выходит нарул у. Такие клетки легко отличить от интактных под фазово-контрастным микроскопом. В конце концов встряхивание со стеклянными шариками приводит к полной деструкции клеточной стенки, и в световом микроскопе можно наблюдать лишь обломки клеток. [c.235]

Сферосомы. Сферосомы (микросомы) были впервые обнаружены в 1880 г. Ганштейном. Они, как свидетельствует само название, представляют собой шаровидные тельца. На препаратах, фиксированных осмием, сферосомы имеют размеры 0,55—0,9 мкм, они хорошо окрашиваются кристалл виол етом в пурпуровый цвет, в то время как митохондрии и пластиды этим же препаратом — в бледно-сиреневый. В отличие от митохондрий сферосомы не окрашиваются янусом зеленым. Поскольку показатель преломления света у этих органелл выше, чем у цитоплазмы, они хорошо просматриваются под световым микроскопом. При темнопольной микроскопии сферосомы представляются в виде блестящих гранул, а при фазово-контрастной они кажутся черными. При извлечении из них Липидов сохраняется остов, окрашивающийся пиронином, что указывает на существование белковой стромы у сферосом. Полагают, что высокая способность сферо-сом к преломлению света обусловлена содержанием в них ароматических аминокислот (тирозина и др.). [c.44]

Рис. 4-10. Фибробластв культуре ткани при наблюдении с помощью четырех различных типов световой микроскопии. А Изображение получено при прямом прохождении лучей через клетку (микроскопия в светлом поле). Остальные изображения получены с помощью методов, рассматриваемых в тексте Б-фазово-контрастная микроскопия В -интфференционная микроскопия Г микроскопия в темном поле. Простая замена компонентов оптики большинства современных микроскопов позволяет получать все четыре типа изображения.

Микроскопия с фазово-коитрастиым устройством основана на том, что с его помощью различия в фазе световых лучей, возникающие при прохождении их через прозрачные объекты, превращаются в амплитудные, в результате чего объекты становятся контрастными. Глаз человека выявляет различия в длине волны света (цвет) и ее амплитуде (интенсивность, яркость), но не в состоянии заметить смещение фазы. Неокрашенные клетки микроорганизмов хорошо видны в проходящем свете обычного светлопольного микроскопа только в том случае, когда значительная часть энергии света, прошедшего через них, поглощается. При этом выходящая из объекта (клетки) световая волна имеет меньшую амплитуду, т. е. яркость, н этот объект воспринимается глазом наблюдателя как более темный, контрастный по сравнению с окружающей средой. Однако многие микроорганизмы, размеры которых лежат в пределах разрешающей способности микроскопа, мало отличаются по прозрачности (плотности) от окружающей среды. Амплитуда световой волны, проходящей через клетки таких микроорганизмов, почти не меняется, поэтому объекты плохо различимы или даже невидимы в обычный светлопольный микроскоп. Поле зрения кажется наблюдателю почти однородным. [c.91]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология