Гель-электрофорез при градиенте концентрации полиакриламида (ПГЭ)

Для контроля за степенью очистки белков чаще применяют метод электрофореза. Большинство авторов в качестве носителя используют гомогенные гели или градиент концентрации акриламида. Основной способ при этом — электрофорез в диссоциирующей среде ДДС-Na соответственно процедуре, которую описал Лэммли [68]. В определенных случаях завершающим приемом при этом являются иммунодиффузия [29, 114] либо иммуноэлектрофорез [17, 80, 118]. При исследовании структуры некоторые авторы прибегают к двумерному электрофорезу. Тогда первая миграция молекул может происходить в гомогенном геле полиакриламида с ДДС-Na или без него во втором направлении молекулы мигрируют в полиакриламидном геле с ДДС-Na в присутствии восстановителей дисульфидных связей (р-меркапто-этанол) [10, 40, 61, 78]. Чтобы охарактеризовать субъединицы легуминов гороха и конских бобов, Матта и др. [77, 78] применяют сочетание ДДС-Na с р-меркаптоэнталом и электрофокусированием. Рестани и др. [92 пользуются этим же способом применительно к глобулинам люпина, а Ху и Еэзен [53] демонстрировали гетерогенность белков сои. Указанные методы с [c.155]

Нуклеиновые кислоты характеризуются отчетливым отрицательным зарядом и очень высокой молекулярной массой. Поэтому нейтральные гомогенные гели с достаточно большими порами обеспечивают хорошее разделение этих соединений. Размер пор, требуемый для исследования нуклеиновых кислот и их субъединиц, можно определить методом гель-электрофореза при градиенте концентрации, как для белков (см. табл. 12.6). Если механические свойства неплотного полиакриламидного геля непригодны, можно использовать смешанный гель, содержащий 2,5% полиакриламида и 0,5% агарозы. При анализе субъединиц более низкой молекулярной массы концентрацию полиакриламида увеличивают до 3% при 0,5%-ной концентрации агарозы в [c.350]

Электрофорез во втором направлении можно также проводить в геле с градиентом концентрации полиакриламида в присутствии ДСН. Такая система была использована для разделения рибосомных белков [89]. Применение градиента геля во втором направлении целесообразно, по-видимому, в тех случаях, когда разделяемые белки имеют молекулярные массы, различающиеся в широких пределах. [c.231]

Возможность для дальнейшего улучшения разделения белков открывает сочетание изоэлектрического фокусирования с электрофорезом в полиакриламидном геле, содержащем ДСН, а также использование различных видов равномерных или скачкообразных градиентов концентрации полиакриламида. [c.228]

В этом методе электрофореза используется электрофоретическое перемещение макромолекул в среде с градиентом плотности пор геля. Конечный результат — разделение смеси на отдельные компоненты в соответствии с размерами молекул, при этом электрофоретическая подвижность не играет существенной роли. Необходимым условием такого разделения является наличие у исследуемых соединений зарядов одного типа и отличной от нуля электрофоретической подвижности в применяемой среде. Движение веществ от старта постепенно тормозится вследствие уменьшения пор геля, и с увеличением расстояния от старта подвижность макромолекул постепенно уменьшается. При больших молекулярных массах нодвил ность уменьшается почти до нуля. Ограничение подвижности, вызываемое гелем, приводит к фокусированию зон. Для того чтобы подвижность снижалась до нуля, наряду с градиентом концентрации акриламида необходимо наличие градиента степени сшивки геля. Поэтому в новых типах гелей имеется градиент концентраций и полиакриламида, и бисакриламида. На этих гелях можно разде- [c.299]

В данном методе используют эффект молекулярного сита, свойственный полиакриламидным гелям различной концентрации. Чтобы улучшить разрешение, рекомендуется на первом этапе проводить электрофорез в геле с низкой концентрацией полиакриламида, а на втором — электрофорез в градиенте концентрации полиакриламида. Такие системы были применены при разделении белков сыворотки крови [821, 1452]. Марголис и Кенрик 821] для электрофореза в первом направлении использовали 2,7%-ный гель, а Райт [1452]—4,75%-ный. Электрофорез во втором направлении проводили в градиенте концентрации 4—20%-ного 1[821] или 2—30%-ного [1452] полиакриламида. Применение в первом направлении 2,7%-ного полиакриламидного геля [821] улучшало разделение белков с большой молекулярной массой, тогда как при электрофорезе во втором направлении разделение было лучше при использовании более крутого градиента [1452]. Об эффективности указанных методов свидетельствует то, что при разделении с их помощью белков сыворотки человека на электрофореграмме было обнаружено более ста зон [1452]. [c.229]

Вскоре после первых сообщений об ИЭФ в геле этот метод в сочетании с электрофорезом был использован для разделения бел ков сыворотки крови [269, 270] и пероксидаз из сока клубней картофеля [794]. Электрофорез во втором направлении можно проводить не в полиакриламидном, а в крахмальном геле, [1460]. Кенрик и Марголис [670] применили для разделения белков сыворотки крови сочетание ИЭФ с электрофорезом в градиенте концентрации полиакриламида. Разделение в 1-м направлении они проводили в градиенте pH 3—10, а во 2-м — в градиенте концентрации геля вогнутой формы (4,5—26% Т)- [c.232]

Миро и др. [876] применяли гели с экспоненциальным градиентом концентрации полиакриламида, приготовленные в кварцевых трубках. Это дало возможность проводить прямое денситометрическое сканирование гелей. Чтобы обеспечить стабильность градиента концентрации акриламида во время полимеризации, создавали параллельный градиент концентрации глицерина. ТЕМЭД и персульфат добавляли в концентрациях обратно пропорциональных концентрации акриламида. Гели готовили на буфере, содержащем триэтаноламин, ацетат натрия и ЭДТА (pH 7,4). Электродные резервуары наполняли тем же буфером с добавлением глицерина, ДСН и дезоксихолата. Ядрышковые РНК из клеток НеЬа наносили на гель в объеме 50 и 800 мкл. Если электрофорез продолжался в течение 9 ч, то разделение было лучше в пробе с объемом 50 мкл, однако через 18 ч в обоих случаях были получены одинаково хорошие результаты (рис. 121). Изучение кинетики электрофоретической миграции показало, что в градиентном геле разные виды РНК движутся с той же относительной скоростью, что и в однородном геле. При использовании экспоненциального градиента концентрации от 1,8 до 15% можно в один прием разделить все клеточные РНК и определить их молекулярные массы. [c.379]

Разделяющий гель содержит градиент концентрации от 4.5 до 20 % полиакриламида. Этот градиент создают с помощью трех каналов перистальтического насоса Р-3 (РЬаппас1а, Швеция). Для того чтобы полимеризация проходила равномерно, полимеризующиеся блоки охлаждают. Для создания ровной верхней границы разделяющего геля на него наслаивают изобутанол, насыщенный водой. Электрофорез проводят в охлаждаемой камере. Стеклянные блоки прижимают специальными зажимами к передней части катодного отсека так, чтобы меньшая пластина была на уровне выреза в передней стенке прибора, а большая пластина бьша выше этого выреза. Носле заливки сочленений 1,5%о агарозой в электродный резервуар наливают верхний электродный буфер. Пластины опускают в нижний электродный буфер. Для того чтобы между прокладками и пластинами не протекал электрический ток, эти стыки проливают расплавленным парафином. Охлаждение гелевых блоков осуществляют, пропуская холодную воду через трубчатый холодильник, встроенный в анодную часть. Этот холодильник охлаждает нижний электродный буфер, в который были опущены стеклянные блоки. [c.59]

Электрофоретическая подвижность двухцепочечных ДНК в полиакриламидном или агарозном геле пропорциональна логарифму их молекулярной массы [107]. По вышеизложенным причинам это соотношение справедливо лишь в случае фрагментов со сравнительно низкой молекулярной массой. Для электрофореза обычно используют трис-буфер с низкой ионной силой, доведенный до pH 7—8 путем добавления NaH2P04, борной или уксусной кислоты [107]. Выбор геля определяется размерами фрагментов, которые необходимо разделить. Электрофоретическое разделение фрагментов, содержащих менее 400 пар нуклеотидов, проводят в 2—10%-ных полиакриламидных гелях, фрагменты длиной в 400—1000 пар нуклеотидов разделяют в комбинированных полиакриламид-агарозных гелях, а более длинные фрагменты —в 0,5—1,0%-ных агарозных гелях [107]. Соединения, существенно различающиеся по молекулярной массе, можно разделить в градиенте концентрации полиакриламидного геля [106]. [c.184]

Анализ фрагмента ДНК в таком геле позволяет определить зависимость между подвижностью фрагмента в полиакриламиде и концентрацией денатурирующего вещества. Образец ДНК наслаивается на всю верхнюю часть геля с градиентом денатурирующих веществ, возрастающим слева направо. В процессе электрофореза фрагменты ДНК в левой части геля (с низкой концентрацией денатурирующих веществ) движутся с большой скоростью, соответствующей скорости двухцепочечных молекул. Градиент подобран так, что при прохождении через гель в этих фрагментах не происходит даже частичного плавления. В правой части, где концентрация максимальная, фрагменты начинают плавиться и резко снижать при этом подвижность практически сразу после вхождения в гель. В участках геля с промежуточными концентрациями плавление происходит в разных точках и наблюдается неодинаковое изменение подвижности. Резкое замедление, проявляющееся в увеличении кривизны полосы, происходит, когда концентрация денатурирующего вещества соответствует значению Тт, при котором наступает кооперативное плавление домена. Число позиций, в которых происходит изменение подвижности, на единицу меньше количества доменов плавления во фрагменте ДНК, так как после плавле-яия последнего домена обе цепи фрагмента начинают двигаться лезависимо и изменение скорости не наблюдается. [c.160]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология