Блокирование фосфатных групп

Блокирование фосфатных групп [c.166]

Таким образом, при работе с основными красителями источниками ошибок количественной цитохимии могут быть 1) неполнота извлекаемости НК экстрагентами и неполнота удаления РНК рибонуклеазой при выявлении неспецифического связывания красителя 2) недоступность части НК красителям вследствие блокирования их фосфатных групп аминогруппами белка или вследствие упаковки молекул НК белками и белково-липид-ными структурами (РНК в рибосомах, РНК и ДНК в компактном хроматине и т, д.) 3) неудачный подбор pH раствора красителя 4) неполная фиксация. [c.151]

Для того чтобы освободить фосфатные группы НК от белков, препарат обрабатывают уксусным ангидридом при 45 или 60° в течение 4 часов. При этом ацетилируют аминогруппы лизина и аргинина и достигают максимального связывания красителя. Идеальным является одновременное блокирование карбоксильных групп белка, которые в слабокислой среде могут конкурировать за краситель. [c.159]

По соотношению свободных и блокированных белками фосфатных групп. Чем больше свободных фосфатных групп, тем меньшая часть ДНК связана с гистонами или другими основными белками. [c.175]

В этом отношении наиболее интересен метиловый зеленый. Этот краситель связывается с ДНК преимущественно за счет свободных фосфатных групп, а также групп, блокированных слабо основными белками. Деблокирование фосфатных групп ДНК тем или иным способом, как правило, резко усиливает адсорбцию метилового зеленого. Это дает возможность использовать его для оценки характера связи ДНК с белками хроматина. [c.176]

По этой причине при наружной посадке молекулы АО не могут конкурировать с белками за фосфатные группы ДНК. Соответственно в клеточном ядре комплекс АО-ДНК с красной флуоресценцией возможен только за счет свободных, не блокированных белками или слабо связанных с ними фосфатных групп ДНК. [c.178]

Состояние ДНК в клеточном ядре, оцениваемое по различным признакам и особенно по соотношению свободных и блокированных белками фосфатных групп, является самым надежным и доступным в настоящее время показателем ее функциональной активности в клетке. [c.183]

С химической точки зрения необходимо изучить реакцию, которая бы проходила полностью за ограниченный промежуток времени (т. е. в которой равновесие сильно смещено вправо). С экспериментальной точки зрения трудно разграничить термодинамический эффект блокирования диссоциации фосфатных групп (приводящего при данных условиях к образованию более стабильных продуктов, чем исходный ангидрид) и кинетический эффект, выражающийся в увеличении положительного заряда на атоме фосфора (т. е. в увеличении его электрофильного характера). В этом случае концепция макроэргических связей вполне оправдана, несмотря на ту критику, которой она подвергалась со стороны химиков. [c.356]

Конечно, как и в случае образования пептидной связи, затрачивается определенная энергия, и поэтому необходима активация. Синтез фосфодпэфирной связи был бы невозможен при простом смешивании фосфорной кислоты с соответствующими защищенными нуклеозидами. Наконец (см. ниже), может потребоваться даже блокирование фосфатной группы. Хотя это не строго необходимо (и не применялось в первых нуклеотидных синтезах), такой метод имеет свои преимущества и в настоящее время наиболее распространен. [c.154]

Пиронин связывается РНК клетки только за счет ее свободных фосфатных групп [3]. Если микроскопический препарат перед окрашиванием обработать хлорамином Т или уксусным ангидридом, т. е. дезаминировать или блокировать аминогруппы белка, то связывание пиронина клеточными структурами, содержащими РНК, усилится. Объясняется это тем, что блокирование аминогрупп белка сопровождается освобождением фосфатных групп РНК, участвующих в образовании фосфоамидных связей [1], [7]. [c.152]

Чувствительность метода оценки состояния ДНК по соотношению свободных и блокированных белками фосфатных групп во много раз возрастает, если основные красители заменить основными флуорохромами и адсорбцию последйих измерять по интенсивности флуоресценции при соответствующих длинах волн. [c.177]

Ранее отмечалось (см. стр. 165), что блокированные белками фосфатные группы РНК недоступны не только РНК-азе, но и циронину. На этом основан разработанный нами метод оценки состояния РНК в клетке [11]. [c.188]

Что касается связи пиридоксального остатка с апоферментом, то она осуществляется за счет фосфатной группы (для катализа она не нужна), водородной связи с азотом пиридинового кольца, гидрофобной связи метильной группы и электростатической связи ионизированного фенольного гидроксила. Ковалентная связь с апоферментом появляется периодически на стадии образования внутреннего шиффова основания. Переход в активном центре при pH 6,3 сопоставляется [25[ с ионизацией фенольного гидроксила. Путем избирательного воздействия на отдельные белковые группы молекулы фермента показано [30, 32, 33[, что в его активном центре расположены одна или две имидазольные группы [25], блокирование которых приводит к инактивации фермента. Резкое снижение активности наблюдается и при блокировании одной сульфгидрильной группы. Эти группы, вероятно, и принимают участие в кислотно-основных превращениях промежуточных шиффовых оснований, хотя в наиболее распространенных механизмах реакции трансаминирования [25] обсуждается лишь действие аминогруппы лизина на нескольких стадиях катализа. Это недостаточно оправдано хотя бы потому, что при pH, соответствующем реакции трансаминирования, аминогруппа является хорошим акцептором, но плохим донором протона, что немедленно затормозит реакцию на стадии депротонирования ЫНз-группы. Кроме того, по стерическим причинам мало вероятно, чтобы одна и та же аминогруппа могла служить эффективным акцептором протона к С -атому пиридоксаля — и фактическим акцептором протона от а-углеродного атома аминокислоты. Поэтому в дальнейшем приводится механизм реакции трансаминирования, следуя работе Полторака [2[, в которой рассматриваются каталитические функции всех кислотно-основных групп активного центра аспартаттрансаминазы. [c.226]

Методика. Обработка меркаптоэтанолом приводит к блокированию эпоксидных групп при сохранении электронейтраль-ной и гидрофильной природы матрицы. Влажные шарики, содержащие присоединенный белок, промывают на пористом стеклянном фильтре (пористость 2) 0,01 М фосфатным буфером, (pH 8,0 10 объемов). Добавляют 5%-ный (об./об.) водный раствор меркаптоэтанола (pH до 7,6ч-8,0 доводят с помощью NaOH) на 1 г влажных шариков и оставляют на ночь при комнатной температуре. Продукт промывают дистиллированной водой (10 раз пятикратными объемами) и переносят в буфер, в котором его предполагается использовать. Влажные шарики хранят при 4 0. Для предотвращения микробного ростд добавляют формальдегид. [c.37]

Реакция гидролиза первого олигодуплекса отличалась сильным замедлением скорости расщепления немодифицированной Т-цепи и полным блокированием гидролиза А-цепи. Близкая картина наблюдалась и в том случае, когда фосфатная группа была удалена с места разрыва. Следует также отметить, что упомянутые модификации сопровождаются искажением вторичной структуры участка узнаваемого эндонуклеазой, (из-за увеличения конформационной подвижности групп атомов, находящихся вблизи разрыва), что вероятно и вызывает очень сильное ингибирование реакции расщепления цепей. Можно предположить, что дефект структуры в узле —Т—G— приводит к нару- [c.91]

Из трех групп, которые необходимо защищать (аминогруппа, фосфатная и гидроксильная), блокирование гидроксила наиболее важно для сведения к минимуму выхода побочных продуктов и изомеров. Поэтому было предложено много защитных групп для блокирования гидроксила. Такое разнообразие очень полезно, поскольку может возникнуть необходимость введения в одну молекулу двух разных гидроксилблокирующих групп. Обычно это бывает нужно при обработке 5 -гидроксильной (первичной) группы отдельно от вторичных. В случае рибонуклеотндов избирательно воздействовать на 2 - и З -вторичные гидроксильные группы сложнее, так как они обладают подобными химическими свойствами. [c.158]

Приготовление иммуносорбента. Br N-активированную сефарозу (I г) обрабатывают, как обычно (с. 297). Полученный гель (3,5 мл) быстро промывают бикарбонатным буфером (pH 8,3) и вносят в раствор антител (20 мг антител в 10 мл бикарбонатного буфера). Инкубируют 2 ч при комнатной температуре, осторожно перемешивая механической мешалкой. Гель промывают в 100 мл того же буфера и переносят для блокирования оставшихся активных групп матрицы в 20 мл глицинового буфера 0,2 М, pH 8. Инкубируют 2 ч при комнатной температуре, постоянно осторожно перемешивая механической мешалкой. На воронке гель отмывают от несвязавшихся иммуноглобулинов и глицина бикарбонатным буфером (pH 8,3), затем ацетатным буфером, pH 4. Цикл повторяют, затем отмывают фосфатным буфером и хранят в нем при 4 С. [c.325]

В настоящее время более общепринятой является не ионообменная гипотеза, а гипотеза существования в клетках ионного насоса, выкачивающего из клеток ионы На+ и накачивающего в них ионы К+. Для. изучения этого процесса были использованы различные методические подходы. Из гигантского аксона кальмара можно, например, удалять всю цитоплазму, а оста ВШуюся клеточную оболочку заполнять различными ионными растворами. Сходным образом можно заполнить и тени эритроцитов. Наличие переноса ионов внутрь клеток и из клеток в окружающую среду наблюдалось как на указанных выше объектах, так и на различных интактных клетках других типов. Оказалось, чтО перенос ионов блокируется ингибиторами, например цианидом, который, как известно, нарушает почти все процессы окислительного метаболизма в клетках. Однако блокирование цианидом сним-ается при добавлении к клеткам АТР или других фосфатных соединений, характеризующихся высоким значением потенциала переноса групп. [c.361]

Присоединение в трис-НС1 (pH 8,3) протекает со средней скоростью, но в итоге гель содержит столько же бора, сколько и в случае проведения конденсации в NaOH или фосфатном буфере. Следовательно, сам трис не реагирует с активированным гелем. Это может быть, кроме того, продемонстрировано отсутствием реакции после 18-часовой инкубации активированного геля в 2,0 М трисе при pH 10,0 и 60 X. На геле до и после обработки иммобилизуются равные количества алифатического диамина, и общее содержание азота в геле не меняется после инкубации. Было обнаружено, что родственное соединение, 2-амино-2-метил-1,3 Пропандиол, также не реагирует с триазинактивиро-ванными гелями. Структурные модели этих двух соединений указывают на то, что в наиболее стабильной форме атом азота стерически экранируется гидроксиметильными группами, которые могут сильно уменьшать его нуклеофильность. Для демонстрации этого факта можно показать, что ни один из этих двух аминов не реагирует с нингидрином с образованием синего продукта. По этим причинам вполне вероятно, что трис в равной степени не будет реагировать и с другими активированными матрицами различных типов и, таким образом, без всяких проблем может быть использован в буферах для присоединения лигандов. В действительности широко распространено мнение о нежелательности использования триса в растворах для присоединения лигандов, и очень часто трис рекомендуется в качестве удобного реагента для блокирования остающихся после иммобилизации лиганда активных групп. [c.172]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология