Избирательное расщепление пептидных цепей

С-Концы пептидных цепей определяются избирательным отщепле нием концевой аминокислоты с помощью специфического фермента — карбоксипептидазы и последующей идентификацией этой аминокислоты. Если макромолекула белка состоит из двух (или более) пептидных цепей, как в случае инсулина (см. рис. 53), то избирательно разрушают дисульфидные мостики окислением (например, надмуравьиной кислотой) и затем полученные полипептиды разделяют путем фракционирования на ионитах. Для определения последовательности расположения аминокислот в каждой полипептидной цепи ее подвергают частичному кислотному гидролизу и избирательному расщеплению с помощью ферментов, каждый из которых разрывает полипептидную цепь только в определенных местах присоединения какой-то одной определенной аминокислоты или одного типа аминокислот (основных, ароматических). Таким образом получают несколько наборов пептидов, которые разделяют, используя методы хроматографии и электрофореза. [c.376]

Решающим критерием наличия одного лишь вида белковых молекул является доказательство однозначной последовательности аминокислот в пептидных цепях. Поэтому большая часть книги посвящена описанию методов определения последовательности аминокислот, избирательного расщепления пептидных цепей, фракционирования пептидов, анализа аминокислот и других приемов. [c.7]

ИЗБИРАТЕЛЬНОЕ РАСЩЕПЛЕНИЕ ПЕПТИДНЫХ ЦЕПЕЙ [c.113]

Расщепление пептидной цепи химическими методами основано на избирательной способности боковых цепей некоторых аминокислот повышать лабильность соседней пептидной связи. Под этим углом зрения были исследованы возможные приемы расщепления пептидных связей при остатках оксиаминокислот, цистеина, триптофана, метионина, ароматических и дикарбоновых аминокислот. [c.127]

Заключительный этап работы при выяснении порядка следования аминокислотных остатков в белковой молекуле—воссоздание первичной структуры белка на основании данных о последовательности их расположения в пептидах, полученных при селективном гидролизе. Так как избирательное расщепление пептидных связей при исследовании первичной структуры белков ведут не менее чем двумя агентами, обеспечивающими разрыв пептидных связей в разных точках полипептидной цепи, то первичные структуры того и другого набора полученных пептидов неизбежно перекрываются. Это открывает возможность воссоздания первичной структуры белка (рис. 28). Если при посредстве секвенатора удалось выяснить чередование аминокислотных звеньев в фрагментах белковой молекулы значительного размера, то это существенно упрощает процесс воссоздания ее первичной структуры. [c.59]

Методы, принятые для определения последовательности аминокислот в белках, широко используют ферментативную деструкцию и последующее изучение осколочных полипептидных цепей небольшого размера и перекрывающегося строения, выделяемых и характеризуемых после проведения процесса деструкции. Тем не менее сохраняется необходимость в разработке избирательных и количественных химических методов расщепления основной цепи макромолекул белков. В последние годы было найдено несколько химических методов расщепления пептидных связей но остаткам метионина, триптофана, гистидина и тирозина. Многие из этих методов очень специфичны, причем расщепление протекает в таких местах молекулы белка, которые недоступны действию ферментов. Эти химические методы могут найти применение для специфического расщепления одной, двух или трех пептидных связей молекулы белка — соседних с аминокислотными остатками, встречающимися в молекуле один, два или три раза соответственно. [c.387]

Если принять, что исследуемый белок состоит из одной полипептидной цепи (как это чаще всего и бывает) или если в результате предшествующего фракционирования был получен одноцепочечный препарат, то на следующем этапе следует осуществить избирательное расщепление полипептида. Наиболее удобным методом для этого служит трипсиновый гидролиз, при котором пептидные связи [c.70]

Иногда второго расщепления полипептида на фрагменты оказывается недостаточно, чтобы найти перекрывающиеся участки для двух или более пептидов, полученных после первого расщепления. В этом случае применяется третий, а то и четвертый способ расщепления, что позволяет в конце концов получить набор пептидов, обеспечивающих перекрывание всех участков, необходимых для установления полной последовательности исходной цепи. При этом для расщепления полипептида можно использовать другие протеолитические ферменты, например химотрипсин или пепсин правда, эти ферменты расщепляют пептидные связи гораздо менее избирательно, чем трипсин (табл. 6-6). [c.152]

Если проводить щелочной гидролиз гликопротеина без восстановления остатков непредельных аминокислот, то образующийся частично деградированный полимер, содержащий звенья аминоакриловой и аминокротоновой кислот, удается расщепить по месту этих звеньев действием брома или других реагентов . Это — первый случай избирательного расщепления пептидной цепи в гликопротеинах химическим путем, открывающий большие возможности при изучении их структуры. [c.572]

В результате ферментативного воздействия, определяли последовательно после каждого отщепления Ы-концевого остатка по методу Эдмана (см. гл. 6). При изучении гемоглобина (Брауницер был удачно применен последовательный гидролиз белка разными про-теолитическими ферментами. В этом случае на белок действовали трипсином, а затем полученные пептиды гидролизовали пепсином, специфичность которого значительно повышали, ограничивая время реакции. Методические трудности, связанные с фракционированием сложных гидролизатов и определением полной структурной формулы белка, были преодолены в результате упорного труда нескольких групп ученых. Мы теперь знаем полную аминокислотную последовательность инсулина, глюкагона, рибонуклеазы, гемоглобина, белка вируса табачной мозаики, а также кортикотропина и других пептидных гормонов приближаются к завершению работы по установлению строения папаина, лизоцима, химотрипсиногена, трипсииогена, цитохрома с успешно продвигается изучение некоторых других белков. Изучение последовательности аминокислот проводилось на частичных кислотных гидролизатах или на гидролизатах, полученных при действии различных протеолитических ферментов. Чисто химические методы избирательного расщепления пептидных цепей не имели до сих пор значительного успеха, и эта область остается еще нерешенной задачей пептидно химии. [c.117]

В 1957 г. Суон [63] предположил, что превращение остатков цистеина и цистина в остатки дегидроаланина может послужить основой метода избирательного расщепления пептидной цепи при этих остатках. Была предложена следующая схема, основанная на реактивности цистеин-5-сульфоната [c.130]

Другие ферменты, например химотрипсин и пепсин (гл. 7, раздГ.2), менее избирательны, но все же их тоже можно использовать для расщепления пептидной цепи на фрагменты с последующим определением структуры этих фрагментов. Для установления полной аминокислотной последовательности белка нужно найти перекрывающиеся фрагменты, содержащие последовательности, в которые входят концы двух разных триптических фрагментов. Таким путем можно выстроить пептиды в том порядке, в котором они расположены в нативном белке. [c.167]

Интересный метод избирательного расщепления пептидных связей по остаткам метионина предложен Гроссом и Уиткопом [71]. Пептид, содержащий метионин, обрабатывают иодацетамидом или бромцианом при этом образуется сульфониевая соль метионина. Под действием теплой воды происходит расщепление пептидной цепи через промежуточную стадию образования иминолактона. [c.132]

Гидролазы. Ферменты этой группы играют особенно важную роль в пищеварении и в процессах пищевой технологии. К ним относится большая группа протеолитических ферментов, катализирующих гидролиз белков и пептидов. Большое значение в биохимии пищеварения принадлежит протеолитическим ферментам (пепсин, химиотрипсин, аминопептидаза, карбоксипептидаза и др.), осуществляющим деполимеризацию молекул белка по мере его движения по пищеварительному тракту. Протеолитиче-ские ферменты участвуют в процессах, происходящих при переработке мяса, в хлебопечении. С их помощью проводят умягчение мяса и кожи, их применяют при получении сыров. Действие протеаз очень избирательно. Одни протеазы разрушают пептидные связи внутри молекул белка — эндопептидазы и на конце ее молекулы (экзопептидазы), т. е. отщепляют аминокислоты с N- или С-конца, другие расщепляют пептидные связи только между отдельными аминокислотами. Так, трипсин разрушает пептидную связь между лизином (Лиз) или аргинином (Apr) и другими аминокислотами, пепсин — между аминокислотами с гидрофобными радикалами, например между валином (Вал) и лейцином (Лей). Фермент химотрипсин гидролизует пептидную связь между триптофаном, (см. схему) тирозином и другими аминокислотами. В самом общем виде схема расщепления пептидных связей в полипептидной цепи может быть представлена следующим образом [c.23]

ТРИПСИНОГЕН — белок (мол. в. 23 700, изоэлектрич. точка при pH 9,3), вырабатываемый поджелудочной железой животных и превращающийся в результате активации в трипсин. Т. представляет собой полипептидиую цепь, состоящую из 229 аминокислотных остатков. Активация Т.— каталитич. процесс, протекающий под действием трипсина при pH 8. Установлено, что при действии трипсина на Т. происходит избирательное расщепление только одной пептидной связи,образованной карбоксильной группой лизина (ограниченный протеолиз). В результате от аминного конца полипептидной цепи Т. отщепляется гексапептид, содержащий 4 остатка аспарагиновой к-ты и обладающий ярко выраженными кислыми свойствами [c.134]

В основе химических методов расщепления лежит способность модифицированных химическим путем аминокислотных остатков активировать полипептидные связи прилегающих звеньев цепи [20, 21]. В химии белка многие годы используется расщепление по остаткам некоторых аминокислот. Приемлемый па практике способ избирательного химического раснюпления полипептидпых цепей должен удовлетворять двум требованиям обладать высокой избирательностью и обеспечивать высокий выход. В идеальном случае при расщеплении отделыюй пептидной связи не должно происходить побочных реакций. Однако на практике известные методы химического расщепления не лишены недостатков прежде всего к ним относятся низкий выход продуктов реакции и нежелательные побочные реакции. [c.82]