Введение метки в зонды

В отличие от введения радикалов-зондов приготовление спин-меченых молекул является химической задачей, требующей во многих случаях новых путей ее решения. Однако часто, например при синтезе целого ряда спин-меченых белков, реакция не требует каких-либо дополнительных реагентов, кроме групп, непосредственно участвующих в связывании [см., например, реакцию (1.4)], и осуществляется по простым схемам. Так, например, приготовление спин-меченых белков состоит из двух этапов [И]. На первом этапе водный раствор белка и радикала-метки при определенной величине pH в течение нескольких часов выдерживается при определенной температуре (обычно несколько градусов Цельсия выше нуля для сохранности белка). Затем не связавшийся с белком радикал отмывается от раствора с помощью диализа либо отделяется на хроматографической колонке. [c.121]

В последние годы в активе молекулярной биологии появились методы и подходы, основанные на использовании новых молекулярных датчиков — стабильных нитроксильных радикалов, связанных ковалентно с макромолекулами (спиновые метки) или введенных в качестве ничтожных примесей в исследуемую систему (спиновые зонды). Вращательная и трансляционная подвижность таких радикалов, измеренная с помощью техники электронного парамагнитного резонанса, дает информацию о структуре, кон-, формационной динамике, микрорельефе и топологии белков, ферментов, мембран и других биомолекул и биологических структурных элементов. Спиновые метки служат своеобразными сейсмическими станциями, чутко регистрирующими малейшие изменения биологических структур при их функционировании или при различных воздействиях на них. [c.3]

Спиновые (парамагнитные) метки и зонды — это стабильные нитроксильные радикалы, ковалентно связанные с макромолекулами или введенные в исследуемую матрицу. Они выполняют роль молекулярных датчиков и дают уникальную информацию о структуре и динамике жидкостей, природных и синтетических макромолекул, твердых полимеров и полимерных композиций, растворов полимеров и других систем [1—4]. [c.121]

Момент мечения ДНК-зондов, очевидно, выбирают так, чтобы можно было использовать Р-нуклеотиды с наивысшей удельной активностью. Введение метки имеет много недостатков, в частности, ее радиоактивность может быть опасна для здоровья. Однако еще важнее, видимо, то, что время полураспада составляет всего 14 дней, поэтому зонды приходится метить заново каждые 1-2 недели. Использование нерадиоактивных меток в ДНК-зондах позволит преодолеть многие из этих недостатков и разработать диагностические наборы для определения нуклеотидной последовательности ДНК мутантных генов, вирусов, микроорганизмов и т.д. [c.75]

Введение метки в зонды [c.68]

Очень важным является использование синтетических олигонуклеотидов в качестве гибридизационных проб (зондов) для поиска нужных рекомбинантных колоний в генноинженерных экспериментах. Олигонуклеотид синтезируется в соответствии с данными, полученными из известной структуры белка илн ДНК, и после введения концевой метки используется для гибридизации [c.378]

Многие биологические системы не содержат групп с неспаренными электронами. Чтобы исследовать такие системы методом ЭПР, в них вводят специфически связывающийся зонд, который содержит радикал. Наиболее распространенными зондами, или спиновыми метками, являются производные нитроксильного радикала. При введении их в биологическую систему необходимо соблюдать определенную осторожность и убедиться в том, что свойства системы существенно не меняются. При удачном включении такой метки она может служить весьма чувствительной репортерской группой. [c.176]

ЭПР-спектроскопия широко применяется для исследования объектов, в которых практически нет собственных неспаренных электронов. В изучаемую систему вводятся так называемые метки, или парамагнитные зонды,— вещества, которые содержат неспаренные электроны. В молекулах меток содержится атом азота с неспаренным электроном на 2ря-орбитали. Изучая спектры ЭПР, полученные в микроволновом диапазоне частот электромагнитных волн, можно судить о переносе меток через мембрану, получать информацию о характере вращения молекул и изучать фазовые переходы в мембранных системах под действием различных факторов. Однако при интерпретации результатов, полученных методом ЭПР-спектроскопии, следует учитывать возможные изменения свойств объекта, которые могут произойти при введении в него метки. [c.124]

Для определения концентрации веществ в большинстве иммунохимических методов к анализируемому раствору, содержащему определяемое соединение и его меченый аналог, добавляют реагент в количестве, намного меньшем необходимого по уравнению (7.12). Как немеченые, так и меченые соединения взаимодействуют с реагентом практически одана-ково, поэтому отношение их концентраций будет одним и тем же в растворе и в связанном состоянии. При этом возможность применения метода во многом определяется доступностью меченого антигена и соответствующих антител. Для введения метки используют различные реагенты радионуклиды, ферменты, красящие вещества, флуоресцентные и хеми-люминесцентные зонды, ионы металлов. До последнего времени в качестве маркеров антител применяли радиоактивные изотопы этот метод назьшается радиоиммунохимическим анализом (РИА). При этом степень [c.298]

В ряде работ изучался вопрос об общей детоксикации и экскреции с лш-триазинов. На примере лабораторных и домашних животных исследован метаболизм хлор- и метилтио-с жж-триази-нов. Исходные пропазин и прометрин выделяются с калом после перорального введения этих препаратов крысам лишь в небольших количествах, а в моче они содержатся в концентрациях, которые находятся за пределами чувствительности методов анализа. В моче обнаружено несколько метаболитов, меченных п отличающихся по строению от оксипропазина [135—137]. При введении крысам через желудочный зонд симазина, атразина, прометона и пропазина симазин выделялся с калом и мочой примерно в одинаковых количествах, а атразин, прометон и пропазин выделялись в основном с мочой. В обоих экскретах через 48 час после введения оказалось приблизительно от 70 до 90% введенной метки [138—141]. Анализ методом ионообменной хроматографии позволил установить в продуктах экскреции присутствие нескольких метаболитов [124, 140—142]. В других опытах молочным коровам скармливали в течение нескольких дней немеченые симазин и атразин, и в их моче были найдены лишь небольшие количества исходных соединений (1—2% введенной дозы). Поскольку примененный метод анализа основан на реакционной способности активного атома хлора, не представляется возможным отделить вклад исходных соединений от вклада продуктов разложения, еще удерживающих этот атом [131, 132]. [c.72]

ДНК-полимераза I (или Pol I) Е. oli находит широкое применение в работе с рекомбинантными ДНК и при определении нуклеотидной последовательности ДНК. Одно из важнейших применений этого фермента связано с введением радиоактивной метки в ДНК in vitro с помошью так называемой ник-трансляции, направляемой ферментом за счет сопряженных полимеразной и 5 З -экзонуклеазной активностей. Этот процесс позволяет добиться необычайно высокого включения радиоактивной метки в ничтожные количества ДНК, т. е. получать препараты с гораздо более высокой удельной активностью (оцениваемой в импульсах в минуту на 1 мкг ДНК), чем при введении метки in vivo. Радиоактивные ДНК-зонды, полученные с помощью ник-транс- [c.113]

Липкие концы ДНК. Комплементарные одноцепочечные участки ДНК, выступающие на противоположных концах двухцепочечной молекулы. Ник-трансляция. Метод введения метки в ДНК основан на том, что ДНК-полимераза Es heri hia oli способна осуществлять деградацию одной из цепей ДНК, в которой до этого был сделан разрез ( ник ), и тут же строить новую цепь, используя неповрежденную в качестве матрицы. Если в реакционную смесь ввести меченые нуклеозидтрифосфаты, то вновь образуемая цепь окажется радиоактивной, что дает возможность ее использования в качестве зонда. [c.51]

Отсюда, при фиксированной концентрации антитела, равновесное отношение концентраций связанного и свободного антигена количественно связано с общей концентрацией лиганда. Это соотношение лежит в основе любого иммуноанализа. Таким образом, если ввести в анализируемую систему фиксированное количество меченого антигена, то можно определить и неизвестную концентрацию антигена. Неизвестную концентрацию антитела определяют при помощи меченых антител. Для введения метки в антитело или антиген можно использовать различные метящие агенты, такие, как радионуклиды, ферменты, красные кровяные клетки, флуоресцентные и хемилюминесцентные зонды или металлы. В радиоиммуноанализе (РИА) и иммуно-ферментном анализе (ИФА) метят антиген, а в иммунорадиометрическом (ИРМА) и иммуноферментометрическом (ИФМА) анализе - антитело. В большинстве методик иммунного анализа требуется порознь определять связанный и свободный меченый антиген или антитело. Поэтому эти методики довольно громоздки и длительны. [c.57]

В методе электронного парамагнитного резонанса (ЭПР фиксируется перегиб на зависимости ширины линии в спектре ЭПР радикалов или парамагнитных зондов, введенных в полимер, от температуры, Исследования ведут на частотах 10 -10 Гц с использованием стабильных радикалов, в концентрациях не более 10 моль/л. В зависимости от способа ввода радикалов различают спиновые зонды - радикалы, растворенные в полимере, и спиновые метки - радикалы, химически связанные с макромолекулами. Считается, что зонды юкализуются в аморфной фазе, а метки могут присоединяться по всей длине или по концам макромолекулы, что позволяет разделить, идентифицировать движение отдельных участков цепей. [c.385]

Последнее существенно. Мы уже ушли от принципа ТВЭ, ибо индикатор (метка), введенный в среду, характеризует температурную зависимость плотности или (с некоторыми оговорками) вязкости разных элементов объема этой среды, безотносительно к частоте. Подвижность метки либо есть, либо ее нет. Опыты основаны не на сканировании, как при первоначальном рассмотрении смысла стрелки действия, а на зондировании, притом локальном. Сигнал мы получаем от зонда, а не системы релаксаторов, занимающих определенный участок релакса-щионного спектра, а поэтому и получаемая информация при [c.299]

Биологическая активность химического соединения определяется его структурой. Естественно, что любое изменение химической структуры биологически активного вещества влечет за собой изменение его биологических свойств — либо количественное (увеличение или уменьшение действующей дозы), либо качественное (изменение направленности действия). Если введение изотопной метки не меняет структуру молекулы и не вызывает изменений в химических и биологических свойствах вещества, то синтез спиновых меток и зондов всегда связан с введением в структуру молекулы новрго фрагмента — нитроксильного радикала. Понятно, что в этом случае приходится мириться с тем или иным изменением биологических свойств спин-меченого производного по сравнению с оригиналом. Спин-меченое производное в той или иной степени моделирует биологическую активность исходного соединения и в этом смысле является его функциональной моделью [1]. [c.119]

В дозе 50 мг/кг веса животного (около 1650 мг/кг в корме), вводимой кроликам ежедневно в течение 21 дня, хлортиамид вызывал снижение привеса по сравнению с контрольными животными, однако при аутопсии признаки поражения внутренних органов отсутствовали. Доза 150 мг/кг в сутки вызывала снижение веса и патологические изменения печени, почек и надпочечников [206]. При пероральном введении хлортиамида теплокровным препарат полностью метаболизируется, и за короткое время основное его количество выделяется с мочой. В табл. 68 приведено распределение метки в организме крыс после введения им С-хлортиамида или С-дихлобенила через желудочный зонд (усредненные данные при введении 6 самкам и 6 самцам по 1,8 мг хлортиамида, меченного по С5—ЫНг-группе, и [c.187]

При введении самцам крыс перорально метомила в дозе 200 мг на 1 кг пищи и затем в желудок (через зонд) в количестве 1,2 мг по существу все количество метки, содержавшейся в соединении, выделялось в течение 24 ч. При этом четвертая часть метки выделялась в виде " СОг, половина в виде СНз СК и четверть — в виде метаболитов, содержавшихся в моче. Природа полярного меченого вещества, выводимого с мочой, не установлена, но доказано, что в моче не содержалось метомила, соответствующего ему оксима, сульфоксида или сульфона [100]. [c.105]

Большинство биологических молекул не содержат неспаренных электронов и потому не могут давать сигнала ЭПР. Для исследования этих молекул методом ЭПР к ним присоединяют один или несколько радикалов, известных под названием спиновых меток. Таким образом, спиновая метка — это искусственный зонд, своего рода репортерская группа. При введении таких групп нужно убедиться в том, что свойства исследуемой молекулы существенно не меняются. Для этого, например, можно измерить биологическую активность исследумых молекул (скажем, каталитическую активность фермента) или проследить за другими их свойствами в присутствии и в отсутствие спиновой метки. Если эти контрольные измерения показывают, что конформация или активность молекул меняется незначительно, то с известной долей уверенности можно утверждать, что исследования с помощью спиновой метки дают достоверную информацию о состоянии системы. [c.174]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология