Нуклеазы

В клетке межнуклеотидные связи в ДНК и РНК расщепляются нуклеазами — обширным классом ферментов, представители которого различаются по механизму действия и специфичности (табл. 1), Среди нуклеаз, приведенных в таблице, нужно особо выделить эндонуклеазы рестрикции (рестриктазы). ферменты (их функции рассмотрены в гл. VI) узнают в молекулах ДНК не отдельные нуклеотидные остатки, а нуклеотидные последовательности из четырех, пяти или шести остатков и поэтому расщепляют любую ДНК на сравнительно небольшое число строго определенных фрагментов. [c.13]

Рис. 60. Схема предполагаемого участия нуклеазы Ree B D (экзонуклеазы V) в инициации гомологичной рекомбинации

Межнуклеотидная связь. Нуклеазы [c.11]

Несколько отличный путь используется для репарации повреждений ДНК, заметно нарушающих структуру молекулы, например пиримидиновых димеров, образующихся под действием ультрафиолета. Такие повреждения удаляет специальный фермент — эндонуклеаза иугАВС (в темноте, когда не работает фотолиаза или когда повреждений в ДНК очень много), а нуклеаза разрывает фосфо-днэфирные связи с 5 - и с З -конца от поврежденного участка, а затем с помощью белка иугО, хеликазы И, поврежденный участок удаляется сопряженно с гидролизом АТР. Образующуюся брешь застраивает ДНК-полимераза I (рис. 46). [c.78]

Рекомбинация не заканчивается образованием полухиазмы. Эта структура должна быть еще соответствующим образом разрезана. Как это осуществляется у бактерий, до сих пор не вполне ясно. Возможно, за это ответственны те же нуклеазы рекомбинации, которые принимают участие в инициации обмена, например нуклеаза Re B D. Воз.можно, существуют специализированные ферменты, специфически разрезающие структуру Холидея. Такие ферменты удалось выделить из клеток, зараженных фагом Т4 или Т7. [c.92]

Аналогичные принципы лежат в основе ферментативных методов анализа вторичных структур РНК- Известно большое число РНКаз, которые направленно гидролизуют фосфодиэфирные связи в однотяжевых участках РНК. Обнаружено также несколько нуклеаз, [c.39]

Вторая группа способов внутренней инициации связана с использованием разрывов, или брешей, в одной из цепей двухнитевой ДНК. Эти перерывы непрерывности могут возникать в результате действия тех или иных нуклеаз на ДНК-матрицу появление разрывов обычно сопровождает процесс рекомбинации. Так или иначе свободный З -ОН-конец цепи ДНК может быть использован в качестве затравки для дальнейшего удлинения этой цепи. [c.266]

Палиндромы в ДНК обнаруживаются путем кратковременной ренатурации денатурированной ДНК, гидролиза всей не успевшей ренатурировать ДНК нуклеазой S1 (специфической для однонитевой ДНК) и задержания на колонке оксиапатита двунитевых фрагментов, которые в этих условиях образуют только палиндромы. Лин и Ли [Lin, Lee, 1979] вели денатурацию фрагментированной ультразвуком ДНК в щелочной среде, а ренатурацию — путем быстрой нейтрализации раствора и выдерживания его при повышенной температуре в течение 2 с. Затем раствор энергично охлаждали до 4° и диализовали на холоду против 0,1 М Na-ацетатного б фера (pH 5), содержавшего 0,1 мМ ацетата цинка, что необходимо для действия нуклеазы S1. Кроме того, к раствору добавляли половинный объем диоксана, который, как оказалось, почти втрое ускоряет и повышает эффективность действия фермента. Наконец, вносили саму нуклеазу 81 (80 ед/мл), выдерживали 45 мин при 37°, а затем, как обычно, гидролизат переводили диализом в 0,12 М Na-фосфат- [c.242]

Идентификация модифицированных нуклеотидных остатков в полинуклеотидной цепи РНК долгое время была задачей особой трудности. С появлением современных методов секвенирования нуклеиновых кислот она существенно упростилась. Модификацию РНК или ее расщепление ферментами ведут таким образом, чтобы (как и при секвенировании) было затронуто в среднем только одно звено на молекулу (в чем есть дополнительный смысл, так как множественная модификация РНК искажает ее структуру). Далее, если изучается РНК небольшого размера или сегмент РНК, примыкающий к одному из ее концов, то этот конец метят радиоактивной меткой и задача идентификации модифицированного основания (после расщепления соответствующего звена) или атакованной нуклеазой межнуклеотидной связи сводится, как и при секвенировании, к определению длины фрагмента по его подвижности в высокоразрешающем электрофорезе в геле. В том случае, когда анализируемый район удален от концов молекулы на расстояние больше 150—200 н. о., используют реакцию обратной транскрипции (см. гл. 13). Для этого синтезируют олигонуклеотид, комплементарный участку РНК, расположенному вблизи от анализируемого района с З -концевой стороны молекулы, и далее используют его как праймер для обратной траискриптазы. Так как этот фермент останавливается на модифицйрованных остатках матрицы (или в том месте, где расщеплена фосфодиэфирная связь), то вновь по длине образующегося фрагмента можно определить положение модифицированного звена в РНК. [c.40]

Полисахариды, в частности гликоген, слабо сорбируются на оксиапатите. Этим можно воспользоваться для существенной очистки НК в ходе их выделения от сопутствующего им гликогена (нередко встречающееся использование для этой цели амилазы рекомендовать нельзя — в ней всегда могут оказаться примеси нуклеаз). [c.244]

Делоншам любезно сообщил нам свои собственные взгляды на механизм, по которому ог-химотрипснн и другие сериновые протеазы могут гидролизовать вторичные амины при стереоэлектронном контроле (рис. 4.7). Петков и др. [119], изучая влияние уходяш,ей группы на реакционную способность анилидов ири гидролизе, катализируемом а-химотрипсином, пришли к подобному же заключению. Кроме того, теория стереоэлектронного контроля была пспользована в приложении к механизму действия рибо-пуклеазы А, нуклеазы стафилококков и лизоцима [120]. [c.256]

В области синтеза белковых веществ за последние годы достигнуты блестящие результаты. Помимо полного синтеза антибиотика грамици дина синтезирован инсулин, осуществлен полный синтез фермента рибо-нуклеазы А. Синтезированный фермент имеет 78% активности природного фермента. Синтезирован пептидный фрагмент фермента N-aцeтил-глюкозаминидазы — лизоцима, структура которого была полностью установлена ранее (см. рис. 56). Синтезированный пептидный фрагмент, проявляет до 25% активности природного лизоцима. [c.377]

Другой пример влияния сверхспирализации на структурные превращения двойной спирали ДНК — образование крестообразных структур. Практически любая ДНК содержит инвертированные, или палиндромные, повторяющиеся последовательности длиной от нескольких п. о. до многих тысяч п. о. Теоретически можно представить себе превращение линейной двуспиральной формы палиндрома в крестообразную (рис. 19). Для релаксированной ДНК вероятность такого превращения ничтожна. Поскольку в ДНК с отрицательными сверхвитками этот переход энергетически выгоден, крестообразные формы in vitro обнаруживаются у всех исследованных сверхспирализованных ДНК с нормальной плотностью сверхвитков. (Экспериментально крестообразные структуры фиксируют по наличию однотяжевых петель в вершине шпилек , которые расщепляются нуклеазами, специфичными к однотяжевой ДИКО Вопрос о существовании крестообразных структур ДНК ш vito остается открытым. Скорость их юбразования очень мала, и, может быть, именно поэтому в клетке их еще никому не удалось обнаружить. [c.33]

Для успешного протекания рекомбинации необходим SSB-белок, который покрывает образованную в результате действия Re B D-белка одноцепочечную ДНК и предохраняет ее от действия нуклеазы без SSB-белка нуклеаза Re B D in vitro, вместо того чтобы осуществлять описанную реакцию, деградирует обе цепи ДНК [c.91]

Механизм действия метилирования не раскрыт. Модифицированная ДНК может оказывать влияние на локальную структуру в составе хромосомы. Вероятно, метилирование отдельных сайтов в составе гена меняет характер взаимодействия с белками и структуру хроматина. Действительно, сайты метилирования в отдельных исследованных генах совпадают с так называемыми гиперчувствитель-ными к нуклеазам сайтами в составе хроматина, наличие которых отражает активное состояние гена или его готовность к активации (см. гл. ХП). Метилирование может влиять и на структуру ДНК-Например, метилирование цитозина в составе синтетических поли-дезоксинуклеотидов с повторяющейся комплементарной последовательностью типа d( pG) -d(Gp ) способствует их переходу в Z-конформацию ДНК. [c.220]

Рис. 126. Электрофорез фрагментов ДНК, образовавшихся при расщеплении микрококковой нуклеазой. хроматнна печени крысы (левая дорожка) н гриба нейроспоры (Правая дорожка)

Обработка микрококковой нуклеазой не единственный способ выявить в хроматине регулярное чередование защищенных участков (нуклеосом) и открытых участков (линкеров). Такая структура подтверждается и с помощью некоторых химических проб, которые модифицируют или расщепляют ДНК- Эти соединения расщепляют ДНК там, где она не связана с белками. Гистоны в составе нуклеосомы защищают ДНК, поэтому при ограниченном расщеплении получается характерная иуклеосомная лесенка. [c.244]

Моно- и ОЛИ ногу клеосомы можно выделить, например, центрифугированием в градиенте сахарозы продуктов расщепления хроматина нуклеазой. Еще более тонкое фракционирование хро-матиновых частиц получают с помощью гель-электрофореза, при котором разделяются нуклеосомы с разной длиной линкера или различающиеся по белковому составу. [c.244]

Существование гиперчувствительных к нуклеазам свободных от нуклеосомных гистонов участков в промоторной и регуляторной областях — обязательный признак активного или потенциально активного в данных клетках гена. Отсутствие гистонов в этих участках может быть обусловлено различными механизмами. Во-первых, некоторые специфические последовательности ДНК, та-лне, как полиёА поли dT, не способны в силу некоторых причин (например, излишней жесткости) сворачиваться в нуклеосомную структуру. Такие свободные от гистонов области гомополимеров найдены, в частности, в промоторных областях некоторых дрожжевых генов, и их присутствие существенно для активного состояния этих генов. Другим механизмом может быть связывание специфических белков с регуляторными участками ДНК, что препятст- [c.256]

Возникновение гиперчувствительных мест в хроматине может быть обусловлено не только отсутствием нуклеосом, но и другими факторами особой локальной конформацией ДНК и/или связыванием негистоновых белков. Хотя большая часть ДНК в хроматине находится в обычной В-конформации, некоторые ее участки могут принимать другую конформацию, например из-за особенностей последовательности. Так, протяженные (более 8—10 п. н.) участки строгого чередования пуринов и пиримидинов в экспериментах in vitro при повышении ионной силы склонны переходить в левоспиральную Z-конфигурацию. Еще одна необычная конформация ДНК —так называемая Н-форма (см. гл. 1). В Н-переход наблюдается в полипурин-полнпиримидиновых последовательно стях при понижении pH. Однако до сих пор не ясно, возможны ли такие переходы в клетке. Известно, что многие нуклеазы с высокой избирательностью расщепляют ДНК на границе между участками с различной конформацией, например В—Z или В—Н. [c.257]

Регуляторные ДНК-связывающие белки прокариот вызывают заметные изменения конформации ДНК. При рентгеноструктурном исследовании комплекса регуляторного белка TFIHA со своим участком ДНК оказалось, что двойная спираль находится в А-форме. Другие изменения (изгибы и изломы двойной спирали) можно обнаружить с помощью электронной микроскопии, электрофореза ДНК-белковых комплексов, а также при действии нуклеаз. Связанный белок защищает от расщепления 15—30 п. о. в месте связывания и порождает два участка повышенной чувствительности к нуклеазам с обеих сторон от места связывания. Тонкий анализ мест гиперчувствительности в хроматине эукариот показал, что они имеют точно такую же структуру — две гипер-чувствительные точки, разделенные защищенны.м участком. [c.257]

Влияние соседних оснований яа частоту возникновения мутаций отмечалось и ранее для прокариотических ДНК-полю-юраз. Авторы [17] предполагают, что соседние основания слева и справа могут иметь большое значение для стабилизации неканонической пары, возникающей в ходе репликации. Похожие закономерности выявлены при анализе спонтанных мутаций, возникающих при трансфекции вектора pZI89 в клетки обезьяны. Для всех мутантных позиций оказалось характерным наличие слева вполне определенных нуклеотидов. Консенсус имеет вид ТС, где нуклеотид С - позиция мутирования. Предполагается, что эти мутации возникли в ходе репарации трансфецированной ДНК, поврежденной клеточными нуклеазами [171. [c.103]

Рис. 102. Фракциопировапие трех нуклеаз селезенки иа колонке оксиапатита (2 X 40 см) элюция линейным градиентом концентрации фосфатного буфера pH 6,8 (от стрелки) [Bernardi et al., 1966]

Еще в 1966 г. Бернарди и соавторы [Bernardi et al., 1966] продемонстрировали возможность использования хроматографии на оксиапатите для очистки ферментов иа примере разделения различных нуклеаз селезенки (рис. 102). Элюцию вели линейным градиентом концентрации фосфатного буфера (0,05—0,5 М), pH 6,8. [c.233]

В одной из недавних работ [ aiafa et al., 1981) белки хроматина после частичного гидролиза микрококковой нуклеазой сорбировали на оксиапатите (в объеме) в 0,001 М К-фосфатном буфере (pH 7,2), [c.235]

По своему существу аффинная хроматография — это особый тип адсорбционной хроматографии. В отличие от того, что было описано в гл. 6, адсорбция здесь осуществляется за счет биоспецифп-ческого взаимодействия между молекулами, закрепленными на матрице, т. е. связанными в неподвижной фазе, и комплементарными к ним молекулами, подлежащими очистке или фракционированию, поступающими, а затем элюируемыми с подвижной фазой. Биоспеци-фическое взаимодействие отличается исключительной избирательностью, а зачастую и очень высокой степенью сродства между партнерами. Оно лежит в основе множества строго детерминированных процессов, протекающих в организме. В качестве примеров можно назвать взаимодействия между ферментами и их субстратами, кофакторами или ингибиторами, между гормонами и их рецепторами, между антигенами и специфическими для них антителами, между нуклеиновыми кислотами и специфическими белками, связывающимися с ними в процессе осуществления своих функций (полимераза.мп, нуклеазами, гистонами, регуляторными белками), а также между самими нуклеиновыми кислотами-матрицами и продуктами их транскрипции. Наконец, многие малые молекулы (витамины, жирные кнслоты и др.) специфически связываются со специальными транспортными белками. [c.339]

Нелгаловаж пым преимуществом аффинной хроматографии является II то обстоятельство, что в ией гидролитические ферменты (про-теазы, нуклеазы п др.) с самого начаДа отделяются от своих субстратов. В частности, этим обстоятельством обусловлен высокий выход очищаемых макромолекулярных препаратов, характерный для аффинной хроматографии. [c.341]

Естественно, что еще более эффективную, чем с гепарином, и избирательную очистку белков метаболизма и регуляции матричной активности можно получить, используя в качестве лигандов сами нуклеиновые кислоты. Аффинные сорбенты с иммобилизованными НК могут обладать не только групповой (белки хроматина, нуклеазы, рестриктазы и др.), но и сугубо индивидуальной снецифично- [c.370]

Молекулярная биология. Структура и биосинтез нуклеиновых кислот (1990) -- [ c.11 , c.15 , c.33 , c.34 , c.39 , c.40 , c.91 , c.133 , c.169 , c.227 , c.239 , c.249 , c.253 , c.256 , c.257 , c.266 ]

Молекулярная биология (1990) -- [ c.11 , c.15 , c.33 , c.34 , c.39 , c.40 , c.91 , c.133 , c.169 , c.227 , c.239 , c.249 , c.253 , c.256 , c.257 , c.266 ]

Биологическая химия Изд.3 (1998) -- [ c.102 ]

Химия углеводов (1967) -- [ c.486 ]

Биологическая химия (2002) -- [ c.142 ]

Биохимия (2004) -- [ c.423 ]

Химия Краткий словарь (2002) -- [ c.204 ]

Молекулярная биология клетки Том5 (1987) -- [ c.27 , c.207 ]

Основы биохимии Т 1,2,3 (1985) -- [ c.857 ]

Общая микробиология (1987) -- [ c.60 ]

Биохимия нуклеиновых кислот (1968) -- [ c.84 ]

Биологическая химия Издание 3 (1960) -- [ c.357 ]

Биологическая химия Издание 4 (1965) -- [ c.376 ]

Основы биологической химии (1970) -- [ c.129 , c.131 ]

Химия и биология белков (1953) -- [ c.398 ]

Биохимический справочник (1979) -- [ c.62 ]

Неорганическая биохимия Т 1 _2 (1978) -- [ c.633 ]

Курс органической химии (0) -- [ c.910 ]

Начала органической химии Кн 2 Издание 2 (1974) -- [ c.700 ]

Начала органической химии Книга 2 (1970) -- [ c.773 ]

Химия биологически активных природных соединений (1970) -- [ c.446 ]

Химия и биология вирусов (1972) -- [ c.177 ]

Ферменты Т.3 (1982) -- [ c.0 ]

Гены (1987) -- [ c.365 , c.366 ]

Биохимия человека Т.2 (1993) -- [ c.92 , c.93 ]

Биохимия человека Том 2 (1993) -- [ c.92 , c.93 ]

Основы гистохимии (1980) -- [ c.106 , c.107 , c.314 ]

Искусственные генетические системы Т.1 (2004) -- [ c.0 ]

Гены и геномы Т 2 (1998) -- [ c.211 , c.211 , c.213 , c.224 ]

Что если Ламарк не прав Иммуногенетика и эволюция (2002) -- [ c.162 ]

Сборник Иммуногенез и клеточная дифференцировка (1978) -- [ c.69 ]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология