Электрофорез зональный

Зональный электрофорез проводят в закрепленной среде, роль которой состоит в стабилизации электрофоретических зон. В зависимости от среды и способа проведения зональный электрофорез имеет много вариантов. [c.145]

Электрофорез проводят либо в свободной незакрепленной среде (в свободной жидкости) — фронтальный электрофорез, либо в закрепленной среде — зональный электрофорез — на крупнопористых носителях (фильтровальная бумага, целлюлоза, порошкообразная пластмасса, агар-агар, ацетилцеллюлоза, стеклянный порошок) или на мелкопористых носителях (силикагель, полиакриламидный гель, целлюлоза, оксид алюминия, крахмал и др.). [c.237]

МЕТОД ЗОНАЛЬНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА [c.10]

Сравнительно новой разновидностью зонального электрофореза является электрофорез на ацетат-целлюлозной мембране [6]. Ацетат-целлюлозная мембрана, по-видимому,— очень хорошая поддерживающая среда, уже нашедшая благодаря ряду достоинств широкое применение. Выше мы отмечали, что приготовление крахмального и агарового гелей—довольно трудоемкая операция, осложняющая метод. В то же время способы предварительной обработки ацетат-целлюлозной мембраны почти так же просты, как и в случае с фильтровальной бумагой. При этом разделение белков происходит лучше и быстрее, а для анализа достаточно 5—1000 мкг белка, растворенного в объеме 0,1—10 мкл. Как белки, так и гликопротеиды очень хорошо окрашиваются на ацетат-целлюлозной мембране, поэтому она является прекрасной поддерживающей средой с точки зрения количественной оценки этих соединений. Электрофорез на ацетат-целлюлозной мембране позволяет получить больше белковых фракций сыворотки крови, чем электрофорез на бумаге, но меньше, чем электрофорез в крахмальном геле. С помощью электрофореза на ацетат-целлюлозной мембране можно определять весьма малые количества индивидуальных белков, благодаря чему он очень подходит для анализа гомогенности выделенного нативного белка. Ацетат-целлюлозные мембраны могут быть использованы также в опытах по иммунодиффузии, что является еще одним достоинством этого метода электрофореза. [c.14]

Более прост экспериментальный метод, представляющий собой сочетание электрофореза с хроматографией. Он назван зональным электрофорезом. В нем одновременно используются различие зарядов и различие сорбционной активности разделяемых веществ. [c.216]

Для выделения ферментов из материалов различного происхождения, их фракционирования и концентрирования разработано множество эффективных методов. К ним относятся кристаллизация [5—7], диализ, ультрафильтрация и концентрирование на полых волокнах (8—10], электрофорез [И—13, гл. 35], экстракция [14, 15], лиофилизация [16], преципитация и методы с использованием растворимых неионных полимеров [17, 18], зональное центрифугирование [19]. [c.9]

Зональный электрофорез в градиенте плотности................65 [c.40]

Широкое распространение в настоящее время получил так называемый зональный электрофорез — электрофорез на твердом носителе (на бумажных полосах, агаре, крахмале, акриламиде), пропитанном буферным раствором с нужным значением pH. Положение белков на бумаге или геле определяют путем фиксации и последующего окрашивания их тем или иным красителем (обычно бромфеноловым синим, ами-довым черным или кумасси синим). Количество белка в каждой фракции можно ориентировочно определять по интенсивности окраски связанного красителя. Такое определение не дает строго количественного соотношения белковых фракций, так как количество красителя, связываемого различными белками, неодинаково. [c.89]

КОМБИНИРОВАННЫЕ МЕТОДЫ ЗОНАЛЬНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА [c.148]

Разработан ряд электрофоретических методов для анализа белков и их смесей. В методе движущейся границы, или фронтального электрофореза, определяется скорость перемещения в электрическом поле резкой границы между раствором исследуемого вещества и растворителем. Для препаративного разделения смесей более удобен метод зонального электрофореза, в котором раствор исследуемого вещества помещают вначале в виде узкого слоя между двумя слоями растворителя. За достаточно большой промежуток времени вещества с различной подвижностью расходятся на значительное расстояние, их зоны перестают перекрываться и продукты разделения могут быть [c.172]

Преимущества методов зонального электрофореза в сравнении с методами свободного электрофореза заключаются в следующем [c.10]

Метод зонального электрофореза имеет и некоторые недостатки. С его помощью нельзя произвести прямого определения скорости миграции белков. Между исследуемыми белками и поддерживающей средой возможны нежелательные взаимодействия, в результате которых часть белка адсорбируется в среде. Адсорбция происходит сильнее всего на бумаге, менее выражена на ацетат-целлю-лозной мембране и практически ничтожна в агаровом геле. [c.12]

При зональном электрофорезе разделение белковых фракций происходит очень быстро. Некоторые методы позволяют закончить всю процедуру, включая окрашивание, за 1—2 ч [7]. [c.11]

Прибор для зонального электрофореза имеет простое устройство и может быть изготовлен даже в небольшой мастерской. Стоимость такого самодельного или имеющегося в продаже прибора зна- [c.11]

Агаровый гель представляет собой очень удобную поддерживающую среду для зонального электрофореза, так как в 1—1,5%- ном агаровом геле белки мигрируют почти так же, как при свободном электрофорезе. По сравнению с бумажным агаровый электрофорез обеспечивает большую разрешающую способность и более быстрое фракционирование белков. Белки окрашиваются в агаре так же хорошо, как и на бумаге. Более того, прозрачность агарового слоя облегчает непосредственное фотоэлектрическое измерение белков. В агаре белковые фракции делятся весьма четко, без образования хвостов , что позволяет наносить большие количества белка, не снижая четкости разделения. [c.13]

Иммуноэлектрофорез сыграл существенную роль в развитии исследований сывороточных белков. В свое время свободный и зональный электрофорезы позволили проанализировать сравнительно небольшое число индивидуальных белков сыворотки. За исключением 5 классических белков, выявляемых в свободном и зональном электрофорезе, остальные фракции сыворотки не всегда легко поддаются идентификации. Поэтому специальные виды зонального электрофореза с более высокой разрешающей способностью, чем простой электрофорез на бумаге, так и не вошли в повседневную практику клинических лабораторий, сохранив свое значение главным образом для научных исследований. Определение процентного содержания альбумина, а-, р- и у-глобулинов нередко помогает поставить верный клинический диагноз, но мы должны помнить о том, что фракции белков, гомогенные в зональном электрофорезе, могут включать разные белки, образующие одну фракцию только благодаря сходной электрофоретической подвижности. Об этом свидетельствует также окрашивание липо- и гликопротеидов. [c.20]

ВВОДИТЬ В количественный анализ электрофореграмм особые поправки они должны привести в соответствие данные зонального и свободного электрофореза. [c.62]

ЗОНАЛЬНЫЙ ЭЛЕКТРОФОРЕЗ В ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЕ [20,21] [c.84]

Поддерживающей средой для электрофореза могут служить фильтровальная бумага, крахмальный или агаровый гели, аце-тат-целлюлозная мембрана, полиакриламидный гель и т. д. Создаваемое в смоченной буферным раствором поддерживающей среде электрическое поле заставляет различные компоненты смеси белков двигаться в определенном направлении со скоростью, соответствующей заряду молекул, что приводит к их разделению. Если электрофорез происходит в крахмальном или полиакриламидном геле, то разделение зависит не только от заряда, но и от величины и формы молекул, так как в этом случае поддерживающая среда выполняет роль молекулярного сита. При электрофорезе в щелочном буферном растворе белки сыворотки крови разделяются по меньшей мере на 5 фракций. При ионной силе 0,1 и pH 8—9 быстрее всех к аноду движется альбумин. За ним следуют в порядке уменьшения скорости миграции а-1-, а-2-, р- и 7-глобулиновые фракции. Подбирая соответствующую поддерживающую среду и буферный раствор, можно улучшить разделение. Поэтому даже в сравнительно малооснащенной больничной или клинической лаборатории зональный электрофорез позволяет проанализировать белки более детально, чем свободный. [c.10]

Область применения электрофоретическое фракционирование белков. Зональный электрофорез в полиакриламидном геле являет- [c.84]

Разрешающая способность иммуноэлектрофореза намного превышает возможности зонального электрофореза, но не следует забывать, что, подобно другим методам иммунодиффузии, иммуноэлектрофорез выявляет минимальное число реагирующих систем антиген—антитело. [c.148]

Вторым широко используемым в биохимии зональным методом разделения смесей является электрофорез. В этом случае зоны создаются в результате того, что разные компоненты смеси с различной скоростью перемещаются в электрическом поле. Скорость перемещения к определяется основным уравнением [c.241]

Исследование белковых соединений методами зонального и фронтального электрофореза. [c.331]

Число фракций, на которые разделяется исходный белок при зональном электрофорезе, можно увеличить не только с помощью специальных методов окрашивания. Простая замена буферного раствора или поддерживающей среды дает тот же эффект. Например, при электрофорезе сыворотки на бумаге в буферном растворе трис-ЭДТА получается не пять, а девять белковых фракций [1 ]. Еще лучшее разделение можно получить в поддерживающей среде, которая обладает эффектом молекулярного сита, например в крахмальном или полиакриламидном гелях. Малые размеры пор этих гелей задерживают миграцию высокомолекулярных белков, так как трение при этом увеличивается настолько, что даже большой электростатический заряд их молекул не может компенсировать замедляющего действия поддерживающей среды. Однако в других поддерживающих средах величина белковой молекулы мало влияет на скорость миграции, поскольку эффект увеличения трения обычно компенсируется ее большим электростатическим зарядом. [c.11]

Иммуноэлектрофоретичесшя характеристика белков сыворотки. Иммуноэлектрофорез применяется для анализа белков сыворотки крови чаще других методов. Его популярность объясняется тем, что, исследуя очень небольшое количество сыворотки, можно охарактеризовать 15—20 белковых фракций вместо 5, доступных для анализа при зональном электрофорезе. Число выяв- [c.144]

Зональный электрофорез в пористой поддерживающей среде. .. 80 [c.40]

Для электрического питания электрофоретических приборов обычно применяют различные нестабилизованные источники питания, напряжение в которых выбирается в соответствии с возможностью отвода тепла из прибора. Пульсирующие источники постоянного тока дают такое же хорошее разделение, как и источники обычных типов с КС- или ЬС-выпрямителем. Эти источники наиболее безопасны, так как напряжение в них после выключения питания сразу же падает до нуля. Вследствие более высокого максимального напряжения пульсирующего источника прибор должен быть настроен на необходимое напряжение. Для более точного и безопасного контроля разделений можно использовать источник стабилизованного тока (проточный электрофорез, зональный электрофорез с носителем, гель-электрофо- [c.324]

Бумажный электрофорез является одним из наиболее распро страненных способов зонального электрофореза, в котором поддер живающей средой служит специальная фильтровальная бумага Она должна быть очень гигроскопичной количество адсорбируе мой ею воды обычно в 130—200 раз превышает ее собственный вес Эти сорта бумаги имеют низкую зольность (55—70 мг на 100 г) и низкое содержание органического азота (10 мг%). [c.12]

Существуют два различных метода электрофореза фронтальный электрофорез, который проводят в свободной незакрепленной среде, и зональный электрофорез — в закрепленной среде (стабилизированная жидкость или носители). Они имеют единую аппаратурную схему источник тока, камеру для электрофореза, два электрода, соединяющих камеру с источником тока, и аппаратуру для сбора и идентификации разделенных веществ. Для электрофореза используют как готовые наборы аппаратуры (универсальный прибор для иммуноэлектрофореза и электрофореза белков на бумаге и крахмале, набор для электрофореза в полиакриламидном геле венгерской фирмы Реанал ), так и наборы, составляемые экспериментатором из отдельных приборов (универсальный источник питания УИП-1, двухлучевой регистрирующий микрофотометр ИФО-451 и др.). [c.144]

В нашей лаборатории горизонтальный электрофорез в крахмальном геле проводят по методу Смитиса [26] в камере для зонального полумикроэлектрофореза следующим образом. [c.80]

При разложении амилозы гидролизом в кислой среде значительно-увеличивается активность иода, необходимая для образования комплекса [26]. Эта активность была измерена методом потенциометрического титрования. Моулд [58] измерил минимальную концентрацию иода, необходимую для полнохо образования комплексов мальтодекстриповых фракций, выделенных из продуктов гидролиза амилозы методом зонального электрофореза в присутствии иода и иодид-иона. Для образования йодного комплекса фракциями, у которых Р = 10- -25 (оранжевого), 25 ч- 40 (красного) и 40 ч- 90 (голубого), необходимо, чтобы концентрация иода в 0,001 М растворе иодида калия была соответственно равна 15-10 , 3,2-10" и 1,0-10 М, в то время как для образования комплекса амилозой, не подвергавшейся гидролизу, достаточна концентрация иода 1-10 М. Комплекс , образованный мальтодекстрином Р — = 40 -т- 90), содерн ал сначала ионную группировку 21 з у1 , которая затем, при добавлении иода до окрашивания системы в голубой цвет, изменилась на ЗТ -г/ у — не определен). Гильберт и Марриотт [34] установили также. Что ионные группировки, необходимые для образования голубого комплекса амилозы, содержат минимум три молекулы иода. [c.537]

Кроме обычного окрашивания, белки, меченные радиоактивным изотопом, после разделения зональным электрофорезом можно выявлять радиоавтографически. Большое значение имеет также тот факт, что с помощью соответствующих субстратов можно непосредственно в поддерживающей среде тестировать ферментативную активность полученных белковых фракций. [c.12]

Однако первая стадия наиболее ответственна, поскольку сама вероятность каталитического акта строго определяется возможностью образования комплекса Михаэлиса. Первично образующееся соединение фермента с субстратом носит название комплекс не вследствие его прямого отношения к классу комплексных соединений, как это понимается в химии, а, скорее, потому, что реальная природа этого соединения пока неизвестна. В огромном большинстве случаев также неизвестны достаточно точно те химические взаимодействия, которые обеспечивают образование комплекса неизвестны и механизмы первичного перераспределения электронов в молекуле субстрата на стадии возникновения первичного комплекса. Более того, до сравнительно недавнего времени мы не имели прямых экспериментальных доказательств реальности существования самих комплексов, которое вытекало в основном из кинетических данных. В 1943 г. были проведены спектральные исследования, свидетельствовавшие о возможности образования промежуточных фермент-субстратных соединений например, в опытах Чанса [13] спектрофотометрическим методом было показано образование комплекса пероксидазы с Н2О2. Были попытки обнаружить фермент-субстратный комплекс методом зонального электрофореза [14]. Однако все эти результаты получены непрямыми методами. В 1963 г. японским авторам Яги и Озава [15] удалось получить прямые доказательства реальности комплекса Михаэлиса. Они выделили стабильный в анаэробных условиях кристаллический комплекс оксидазы D-аминокислот (D-аминокислота О 2 — окси-доредуктаза, КФ 1.4.3.3) с D-аланином (рис. 6). Этот комплекс содержал, помимо апофермента и субстрата, флавинадениндинукле- [c.48]

Однако в ряде случаев, чтобы добиться необходимого разделения в аппаратах для средневольтного электрофореза, требуется значительно увеличивать продолжительность опыта. Этот недостаток в известной мере обесценивает ту легкость, с которой эти приборы можно изготовить даже в самой простой мастерской. С увеличением продолжительности электрофореза возрастает эффект диффузии, и границы зон теряют свою четкость. В то же время высоковольтный электрофорез при градиенте напряжения 50—100 В/см позволяет примерно в 2 раза сократить продолжительность опыта, что уменьшает диффузию и увеличивает четкость зональных границ. [c.95]

Существует много электрофоретических методов. Наиболее эффективным из них является зональный электрофорез. При зональном электрфорезе смесь исследуемых веществ помещают в виде узкого слоя (зоны) на твердую поддерживающую пористую среду. В течение некоторого времени вещества с различной подвижностью разделяются на отдельные зоны и могут быть по отдельности извлечены или идентифицированы без извлечения. [c.121]

При исследовании компонентов моноклонального иммуноглобулина Гоббс [15] применил тонкослойную гель-фильтрацию сыворотки в сочетании с зональным электрофорезом и иммуноэлектрофорезом. Такое сочетание эффекта молекулярных сит и иммунной преципитации позволило обнаружить очень интересный компонент иммуноглобулина, представляющий собой половину молекулы иммуноглобулина О [26]. Парвес [27] предложил применять гель-фильтрацию в тонком слое для диагностики болезни тяжелых цепей , характеризующейся присутствием в сыворотке и моче больных аномального белка, напоминающего тяжелую полипептидную цепь иммуноглобулина О (или А). Этот пример приведен на рис. 3. [c.264]

Метод движущейся границы (фронтальный электрофорез) неудобен для препаративного разделения. Для этой цели более удобным оказался так называемый зональный электрофорез, различные модификации которого появились позднее. При зональном электрофорезе раствор исследуемых веществ помещают вначале в виде более или менее узкого слоя (зоны) между двумя слоями растворителя. За достаточно большое время вещества с различной подвижностью расходятся на такое расстояние, что занимаемые ими зоны не перекрываются и могут быть извлечены по-отдельпости. [c.41]

Аналитическая химия. Т.1 (2001) -- [ c.237 ]

Аминокислоты, пептиды и белки (1976) -- [ c.10 ]

Биохимия нуклеиновых кислот (1968) -- [ c.34 ]

Методы химии белков (1965) -- [ c.244 ]

Ферменты Т.3 (1982) -- [ c.68 ]

Методы исследований в иммунологии (1981) -- [ c.58 , c.356 , c.359 ]

Структура и функции мембран (1988) -- [ c.112 , c.113 ]

Физическая Биохимия (1980) -- [ c.224 , c.225 , c.239 ]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология