Трипсин фосфорилирование ДФФ

В зависимости от механизма действия различают ферменты с относительной (или групповой) и абсолютной специфичностью. Так, для действия некоторых гидролитических ферментов наибольщее значение имеет тип химической связи в молекуле субстрата. Например, пепсин в одинаковой степени расщепляет белки животного и растительного происхождения, несмотря на то что эти белки существенно отличаются друг от друга как по химическому строению и аминокислотному составу, так и по физико-химическим свойствам. Однако пепсин не расщепляет ни углеводы, ни жиры. Объясняется это тем, что точкой приложения, местом действия пепсина является пептидная —СО—КН-связь. Для действия липазы, катализирующей гидролиз жиров на глицерин и жирные кислоты, подобным местом является сложноэфирная связь. Аналогичной групповой специфичностью обладают трипсин, химотрипсин, пептидазы, ферменты, гидролизующие а-гликозидные связи (но не 3-гликозидные связи, имеющиеся в целлюлозе) в полисахаридах, и др. Обычно эти ферменты участвуют в процессе пищеварения, и их групповая специфичность, вероятнее всего, имеет определенный биологический смысл. Относительной специфичностью наделены также некоторые внутриклеточные ферменты, например гексокиназа, катализирующая в присутствии АТФ фосфорилирование почти всех гексоз, хотя одновременно в клетках имеются и специфические для каждой гексозы ферменты, выполняющие такое же фосфорилирование (см. главу 10). [c.142]

Рис. 17-15. Разрушение внутренней мембраны митохондрий ультразвуком, получение мембранных пузырьков, лишенных способности к окислительному фосфорилированию, и реконструирование структур, способных осуществлять этот процесс. Под действием ультразвука кристы внутренней митохондриальной мембраны разрушаются. Затем края мембранных фрагментов смыкаются и образуются замкнутые мембранные пузырьки, в которых головки грибовидных выростов, или р1-головки, обращены не внутрь, а наружу. Если обработать эти инвертированные пузырьки мочевиной или трипсином, то Г1-головки от них отделятся. Обработанные таким способом пузырьки, все еще содержащие Р<,-компоненты, сохраняют способность к переносу электронов, но уже не могут осуществлять фосфорилирование. Если теперь к таким потерявшим свои головки пузырькам добавить молекулы р1, то эти молекулы вновь соединятся с р -единица-ми, сохранившимися в мембране пузырьков.

После доказательства того, что диизопропилфторфосфат не только присоединяется к ферменту, но и прочно связывается (например, фосфорилированные химотрип-син и трипсин можно было выделить в кристаллическом состоянии), больше не осталось никаких сомнений в том, что имеет место фосфорилирование производными фосфорной кислоты окси- и особенно амино- и иминогрупп белковых молекул исследуемого фермента. Поэтому не требуется подробных доказательств того, что на основе таких замещений различных производных аминокислот можно сделать вывод о структуре сложных белковых молекул, входящих в состав ферментов. [c.195]

Известен еще один способ активации КФ, связанный с действием протеолитических ферментов [23, 24, 48, 111—ИЗ]. В ранних работах в препаратах КФ из мышц был обнаружен белковый ки-назо-активирующий фактор (КАФ), повышающий активность фермента при pH6,8 [ИЗ—115]. Этим фактором оказалась Са +-зависимая протеиназа [116]. Эффект активации фермента при ограниченном протеолизе трипсином и химотрипсином наблюдали также при изучении КФ из сердца и мозга [38, 115, 117]. Активирующее действие эндогенных протеиназ выявлялось при хранении очищенных препаратов КФ, которые за две недели при 4°С активировались в 12 раз [23]. Имеет ли физиологическое значение активация КФ протеолизом, пока остается неясным. Однако он широко использовался для изучения регуляторных свойств и функциональной роли субъединиц КФ [21, 23, 54, 112, ИЗ, 118, 119]. В нашей работе с этой целью был применен субтилизин, действие которого вызывало 10-кратное увеличение активности КФ при рн 6,8. Одновременно с активацией фермента исчезала зависимость активности от Са . Такое же явление оказывало действие трипсина [14]. Протеолиз КФ субтилизином протекал более медленно, чем протеолиз трипсином, и это давало возможность детально анализировать изменение активности и структуры фермента во времени. Под действием протеиназ первой разрушалась -а-субъединица. Если сравнить активацию фермента цАМФ-зави- симой протеинкиназой, которая главным образом зависела от фосфорилирования р-субъединицы, то активация протеолизом коррелировала с деградацией а-субъединицы. Следовательно, механизмы этих двух путей активации различны., хотя в обоих случаях [c.62]

Для отщепления дуплекса от твердого носителя либо разрушают ковалентную связь стартового олигомера с носителем, либо расщепляют его по заранее введенным сайтам рестрикции. Если стартовый олигомер не связан ковалентно с остальной последовательностью (в том случае, когда ближайший к нему олигонуклеотид не был фосфорилирован или между ними была специально оставлена небольшая брешь), препарат ДНК подвергают кратковременному нагреванию, достаточному для отщепления, но не полной денатурации ДНК. Примером использования этой стратегии может служить синтез генов ингибитора трипсина из молозива коровы и /З-эндорфина. [c.69]

Др. тип регуляции активности ключевых ферментов-их хим. модификация (напр., обратимое ковалентное фосфорилирование, гликозилирование). Нек-рые ферменты активны в модифицированном, а ряд ферментов - в немодифици-рованном состоянии. Хим. модификация и превращение модифицированного фермента в исходную форму катализируются разными ферментами, чаще всего аллостерич. природы, к-рые, т. обр., выступают в роли регуляторов активности ферментов. Так, катализирующая фосфорилирование белков, в т. ч. ферментов, цАМФ-зависимая протеинкиназа-тетрамерный белок, состоящий из двух типов субъединиц (полипептидов). Фермент активен лишь после связывания двух молекул циклич. аденозинмонофосфата (цАМФ) с двумя регуляторными субъединицами в результате такого связывания фермент диссоциирует на две каталитически активные субъединицы и димер, с к-рым связаны две молекулы цАМФ. Т. обр., изменение активности ферментов путем их хим. модификации дополняет аллостерич. регуляцию и составляет часть каскадного механизма регуляции. Хим. модификацию ферментов осуществляют также специфич. протеазы, катализирующие ограниченный протеолиз и тем самым инактивирующие ферменты (напр., разрушая апоформы ферментов) или, наоборот, превращающие неактивные проферменты (напр., проферменты пищеварит. протеаз-пепсина и трипсина) в каталитически активные формы. [c.219]

Избирательное фосфорилирование специфического остатка серина в так называемых сериновых протеиназах , таких, как химотрипсин, трипсин и тромбин, впервые осуществлено Янсеном с сотр. [167—169], применившим в качестве реагента диизо-пропилфторфосфат (ДФФ). Воздействие на эти ферменты мочевины [170—171] или фотоокисление (в присутствии метиленового синего) остатка гистидина активного центра, близкого остатку серина [85, 95], приводит к тому, что такие белки уже не удается модифицировать с помощью ДФФ. ДФФ не инактивирует бромелайн, папаин или така-амилазу А [172], поскольку эти ферменты не принадлежат к группе сериновых протеиназ вместо остатка серина они имеют в активном центре остаток цистеина. С помощью ДФФ в них можно фосфорилировать некоторые остатки тирозина, но не 5Н-группу активного центра [56, 173]. Напротив, -нитрофеннлацетат (НФА) ацетилирует 5Н-группу глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназы и тем самым инактивирует этот фермент [174, 175]. [c.367]

Имидазольная группировка входит в активные центры таких ферментов, как холинэстераза, рибонуклеаза, трипсин, хи-мотрипсин и др. Особенной способностью к присоединениям обладает атом N3 имидазольной группировки, что приводит к ее ацилированию и фосфорилированию с образованием неустойчивых Ы-ацил- и Ы-фосфорилпроизводных в качестве промежуточных веществ при ферментативных превращениях. Однако несомненно, что строение активного центра в целом непосредственно связано с вторичной и третичной структурой бел- [c.217]

В качестве особого случая фосфатазного действия можно рассматривать реакцию, в которой субстратом служит фосфорилированная холинэстераза. В гл. 2 описано, как это соединение медленно спонтанно гидролизуется с образованием замещенной фосфорной кислоты и активной холинэстеразы и как этот гидролиз ускоряется некоторыми агентами, такими, как оксимы. По-видимому, этот гидролиз может быть ускорен также под действием ферментов. Показано, что табуназа реактивирует холинэстеразу, угнетенную табуном [10, 14]. Трипсин удваивает скорость восстановления активности ложной холинэстеразы, угнетенной разными ФОС [28]. Поскольку трипсин разрушает ацетилхолинэстеразу, он не может быть использован для реактивации этого фермента. [c.155]

В 1962 г. появилась работа [409], являющаяся продолжением исследований Коэна, Эрленджера и сотрудников [410] по реактивации фосфорилированных эстераз. В работе исследовалась кинетика реактиваций диэтилфосфорилированного трипсина различными гидроксамовыми кислотами и оксимами. Была установлена выраженная зависимость между скоростью дефосфорилирования активного центра трипсина и основностью нуклеофильных реагенто [c.585]

В качестве метода фосфорилирования, который, повидимому, является специфическим по отношению к алифатическим гидр-оксильным группам белков, предложена обработка белка в течение нескольких дней при комнатной температуре пятиокисью фосфора (PzOs), растворенной в 100%-ной фосфорной кислоте [135]. Поскольку инсулин устойчив в кислой среде, его гормональная активность, как и следовало предполагать, в результате такой обработки не исчезает [136]. Обработка овомукоида 85%-ной серной или фосфорной кислотой приводит к частичной потере его способности ингибировать трипсин [27]. Реакция протекает при комнатной температуре в присутствии кислоты, и большинство белков при этом должно денатурироваться. [c.321]

Рис.З. Зависимость логарифма константы скорости фосфорилирования активного центра трипсина под действием соединений ( H2 j 0)( H P(0)SX от и. X = н-С Нд (I), gH gHg (II) и С2Н (СНз)С2Нд (III). Условия опытов см. в таблице.

В результате ограниченного трипсинолиза фермента из скелетной и сердечной мышц (рис. 19) образуются крупные фрагменты с кажущимися молекулярными массами около 55 и 45 кД (расщепление в участке Т, фрагменты А и В соответственно). Более длительная обработка фермента трипсином приводит к появлению фрагментов с кажущимися молекулярными массами 30 и 20 кД (фрагменты А и Лг соответственно, расщепление в участке Tz). На основе данных об аминокислотной последовательности фермента истинные молекулярные массы фрагментов составляют 55, 54, 33 и 20 кД. Фосфорилированный под действием [у- Р] АТФ интермедиат АТФазы оказывается локализованным в Л-фрагменте и его триптическом производном Л 1-фрагменте (рис. 19). [c.62]

Одна из возможностей, на наш взгляд, состоит в том, что высокая АТФазная активность митохондриальной АТФ-синтетазы является биохимическим артефактом, вызванным воздействием, необходимыми для получения субмитохондриальных частиц или растворимого Рь В связи с этим уместно отметить, что АТФазная активность сопрягающих факторов из других организмов (хлоро-пласты растений [93], некоторые микроорганизмы [94]) очень низка, но она может быть активирована сильными химическими воздействиями (тепловая обработка, обработка меркаптоэтанолом, трипсином). Митохондриальный АТФ-синтетазный комплекс также содержит специальный низкомолекулярный белковый ингибитор (см. обзор [95]), и препараты растворимого р1 или субмитохондриальных частиц быстро теряют гидролазную активность при их инкубации с белковым ингибитором и АТФ [96]. Фактически для получения активной митохондриальной АТФазы приходится применять специальные воздействия для удаления белкового ингибитора [61]. Интересно, что, блокируя гидролазную реакцию, белковый ингибитор практически не влияет на окислительное фосфорилирование [97]. Для объяснения этого явления была предложена гипотеза о Д .1Н+-зависимой диссоциации комплекса АТФазы с белковым ингибитором [98]. Эта гипотеза экспериментально не доказана. Более того, далеко не все экспериментальные факты [c.48]

В. Чтобы поддерживать свое активированное состояние при последовательных переносах, MPF должен обладать способностью к са-моактивации. Если бы, например, эта была протеаза, она могла бы активировать собственный неактивный предшественник путем расщепления, подо.бного расщеплению трипсиногена трипсином с образованием дополнительного количества трипсина. Однако в случае MPF более вероятно, что активный MPF действует как протеинкиназа, активируя свой неактивный предшественник путем фосфорилирования. При этом, по-видимому, совсем необязательно, чтобы MPF активировал сам себя он мог бы, например, активировать другую протеинкиназу, которая в свою очередь активировала бы предшественник MPF. Тем не менее принцип был бы тот же самый. [c.475]

Триптофан-5-гидроксилазы гидролизуют триптофан сходным образом, с обязательным участием т етращдробиоптерина и кислорода. Предполагается, что тирозингидроксшгаза активируется фосфорилированием с участием циклических нуклеотидов. ММ тршггофангидроксилазы составляет для нативной формы 220 кДа, а по данньм электрофореза в ПААТ в присутствии додецил-сульфата натрия или после обработки трипсином имеет мономерные субъединицы 55,0-60,9 кДа. [c.73]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология