Панкреатическая рибонуклеаза

Рибонуклеаза. — Одна из рибонуклеаз была выделена в кристаллическом виде из бычьей поджелудочной железы Купит-цем (1940). Панкреатическая рибонуклеаза гидролизует рибонуклео-тидные связи, в которых пиримидиновый нуклеозид этерифицирован по З -положению сахара. Этот фермент содержит 124 остатка аминокислот и четыре дисульфидные связи. Установление первичной структуры этого фермента Муром и Штейном (1960) явилось важной вехой в химии белка. Последовательность частично была определена на окисленной рибонуклеазе, которая при энзиматическом расщеплении дает 24 пептида. Их размеры позволяют непосредственно определить последовательность химическими и ферментативными методами. Наконец, ферментативный гидролиз нативного белка, разделение содержащих цистин пептидов, окисление их до цистеиновых пептидов и аминокислотный анализ последних позволили выяснить, каким образом восемь по-луци1стинооых о статков связаны друг с другом (рис. 27, стр. 740). [c.739]

Поскольку обработка реакционной смеси после образования каждой последующей пептидной связи (удлинения полипептида) очень упростилась, стало возможным автоматизировать процесс синтеза, что, таким образом, привело к ускорению полипептидного синтеза. Таким методом был проведен первый химический синтез фермента (панкреатическая рибонуклеаза быка, 124 аминокислотных остатка). [c.90]

РАСЩЕПЛЕНИЕ РНК ПАНКРЕАТИЧЕСКОЙ РИБОНУКЛЕАЗОЙ [c.176]

Рис. 3-8. Денатурация и ренатурация на примере панкреатической рибонуклеазы (по Анфинсену).

Щелочной гидролиз РНК Дает смесь 2 - и З -нуклеотидов. Механизм этого процесса связан с участием свободных 2 -0Н-групп рибозы и образованием циклических 2, 3 -фосфатов и аналогичен механизму действия панкреатической рибонуклеазы (гл. 7, разд. Д.2). Поскольку у дезоксирибозы нет свободной 2 -0Н-группы, ДНК в щелочной среде не разрушается. [c.166]

Гидролизующий полинуклеотиды бактериальный фермент, который широко используется для анализа ближайших соседей (гл. 2, разд. 3,4), может осуществлять гидролиз ДНК и РНК до З -нуклеотидов. Установлена трехмерная структура молекулы нуклеазы стафилококков, состоящей из 149 аминокислотных остатков [69—71]. Так же как и в случае панкреатической рибонуклеазы, молекулу нуклеазы стафилококков можно расщепить на два активных пептида (фрагменты, построенные из остатков 6—48 и 49—149), которые, соединяясь, образуют комплекс, обладающий ферментативной активностью [71, 72]. Комплекс образуется даже в том случае, когда от меньшего пептида отщеплены остатки 43—48. Однако остаток 01и-43, который связывает имеющий существенное значение ион Са +, необходим для проявления ферментативной активности [72], так же как и пептидная связь с соседним треонином (Тге-44). [c.124]

Доказать термодинамическую гипотезу свертывания очень трудно. Обычно полагают, что термодинамическая гипотеза подтверждается экспериментами по повторному свертыванию панкреатической рибонуклеазы [4351. В этих опытах восстановленная несвернутая рибонуклеаза повторно окислялась в присутствии 8 М мочевины причем образовывалась случайная система водородных связей. В результате получалось около 100 различных продуктов, каждый из которых характеризовался своим набором из 4 дисульфидных связей (возможны (2-4) /2 -4 = 105 систем связей S—S [436, 4371 кроме того, существуют различные теоретические возможности образования петель. Удаление мочевины и добавление меркаптоэтанола (рис. 4.3) приводило к постепенному и в конечном счете количественному образованию нативной структуры. Этот факт показывает, что исходя из 100 различных групп, находящихся в исходных конформациях, можно получить нативную структуру. Хотя это число и невелико, данный опыт свидетельствует об уникальности продукта свертывания, однако он не позволяет решить вопрос о локальном или глобальном минимуме. [c.182]

Фиг. 3. Структура инсулина [А) и панкреатической рибонуклеазы ( ) крупного рогатого скота и белка вируса табачной мозаики В).

Полную первичную структуру панкреатической рибонуклеазы расшифровали в 1955 г. С. Мур и У. Стейн. [c.119]

По- идимому, необходимая для этого пространственная структура может быть реализована большим числом способов. С этим связано то обстоятельство, что один и тот же в функциональном плане белок может быть представлен у разных видов живых организмов полипептидами, существенно отличающимися по своей первичной структуре. Это уже было продемонстрировано в табл. 2.2 на примере ряда панкреатических рибонуклеаз млекопитающих. [c.90]

Таким образом, установленные экспериментально структура активного центра и схема расположения 6 нем аналога субстрата логично объясняют все характерные особенности действия панкреатической рибонуклеазы. [c.203]

Аффинная хроматография 5-пептида и 5-белка, образованных в результате протеолитического расщепления бычьей панкреатической рибонуклеазы, обсуждалась в разд. 4,4. Хроматография может даже быть использована для очистки синтетических аналогов 5-пептидов (см. табл. 11.1). Выделение пептидов, содержащих свободную 5Н-группу, рассматривалось в разд. 6.6. [c.130]

Бычья панкреатическая рибонуклеаза А была тщательно исследована с помощью ПМР. Однако удалось достоверно идентифицировать только атомы водорода при С-2 имидазола четырех гистидиновых остатков. Син- [c.204]

Уделив внимание некоторым механизмам гидролиза, интересно сравнить их с механизмом реакции, происходящей в активном центре некоторых ферментов, катализирующих подобные превращения. Фермент бычья панкреатическая рибонуклеаза А (РНаза А) (М = 13 680, одна полипептидная цепь, состоящая из 124 аминокислотных остатков) катализирует деградацию РНК по двустадийному механизму [c.126]

Коммерческие препараты панкреатической рибонуклеазы негомогенны. Они состоят из двух основных компонентов Л и 5, с близкой структурой и свойствами, но различающихся по своей специфичности. На долю компонента Б обычно приходится от 10 до 20% от исходного препарата белка. Разделение фракций Л и осуществляют хроматографически на колонке с КМ-целлюлозой (или на амберлите IR —50/ХЕ-64). [c.113]

Полученные полимеры по своим свойствам напоминают природные олигонуклеотиды под действием кислот и щелочей они распадаются с образованием смеси 2 - и З -фосфатов нуклеозидов, под действием фермента змеиного яда дают 5 -фосфаты нуклеозидов. Однако их отношение к панкреатической рибонуклеазе, избирательно расщепляющей только З -фосфаты, отличает их от природных РНК- Этот фермент, как уже указывалось выше (стр. 249), полностью расщепляет природный полимер синтетические полимеры, напротив, расщепляются лишь частично и разбиваются на олигонуклеотиды с меньшей степенью полимеризации, уже не способные к расщеплению указанным ферментом, но подвергающиеся кислому и щелочному гидролизу. Этот результат вполне естествен и подтверждает, что в синтетическом полимере, в отличие от природных РНК, наряду с 3 -5 -связью (VHI) имеется и 2 -5 -связь (IX), не расщепляющаяся панкреатической риГонуклеазой. Образование последней происходит при раскрытии полимеряого циклического фосфата (VII) наряду с полимером, характеризующимся 3 -5 -связью. [c.250]

Экзонуклеазы отщепляют нуклеотиды с концов полинуклеотидных цепочек, в то время как эндонуклеазы делают разрывы внутри цепи. Одни из них гидролизуют лишь одноцепочечные молекулы, другие— двухцепочечные. Некоторые нуклеазы разрывают обе цепи ДНК, тогда как другие надрезают молекулу, внося разрыв лишь в одну из цепей. Специфичность ряда нуклеаз отражена в табл. 2-11. Частичный ферментативный гидролиз РНК дает расщепление молекулы на короткие нуклеотидные последовательности, позволяющие далее определить полную последовательность РНК. (Первой РНК, для которой установлена последовательность, была аланиновая тРНК. Расщепление проводили с помощью панкреатической рибонуклеазы и рибонуклеазы Т1 [133]. Очень полезным методом получения нуклеотидных карт оказался двумерный электрофорез в полиакриламидном геле [134]. [c.168]

Аналогичные трипсину и химотрипсину ферменты, расщепляющие по мономерным остаткам определенного типа, существуют и для рибонуклеиновых кислот. К их числу относится рассмотренная ранее панкреатическая рибонуклеаза, или, как ее сокращенно называют, РНКаза А. Этот фермент специфично расщепляет РНК после остатков пиримидиновых нуклеотидов с образованием на первом этапе на образовавшемся новом 3 -конце отщепленного фрагмента 2 , 3 -циклофосфатной группы, а на 5 -конце второго фрагмента — свободной 5 -гидроксигруппы [c.275]

Свертывание может происходить значительно быстрее, чем синтез цепи. Свертывание in vitro осуществляется чрезвычайно быстро, по крайней мере для малых белков, не содержащих дисульфидных мостиков. Нуклеаза стафилококка повторно свертывается в течение 1 с [438], а метмиоглобин — в течение 10 с [439]. Если эти величины применимы также и к условиям in vivo, свертывание цепи может происходить по крайней мере в 10 раз быстрее, чем биосинтез аминокислотной последовательности. Дисульфидсодержащие белки, например панкреатическая рибонуклеаза, повторно свертываются за время от 1 до 10 с, если дисульфидные связи не были разорваны в процессе предшеств ющей денатурации [440]. Однако если такие белки развернуты и восстановлены, последующее свертывание цепи (которое включает образование правильной системы дн-сульфидных связей) продолжается при оптимальных условиях в течение многих минут. [c.182]

Повторное свертывание модифицированных белков дает информацию о процессе свертывания. Исследования повторного свертывания нативных белков были дополнены опытами по повторному свертыванию модифицированных белков. В ранних исследованиях [445] было показано, что рибонуклеаза поджелудочной железы, иодинированная по расположенному на поверхности нативной структуры Туг-115, после денатурации теряет способность к повторному свертыванию. Эго показывает, что состояние остатка Туг-115 имеет важное значение для процесса свертывания. Для того чтобы установить, можно ли модифицировать белок (путем расщепления цепи и делеций в последовательности или путем присоединения объемных трупп к боковым цепям) без потери им способности к свертыванию, был проведен ряд систематических исследований нуклеазы стафилококка и панкреатической рибонуклеазы. [c.183]

Получают как промежуточное соединение при гидрол. РНК рибонуклеазой Т, из такадиастазы или щел. Легко превращается в З -фосфат нуклеазой Т, и рибонуклеазой из листьев растений и в смесь 2 - и З -фосфатов разб. кисл. и щел. Не атакуется панкреатической рибонуклеазой. [c.79]

Получается в качестве промежуточного продукта при гидрол. РНК панкреатической рибонуклеазой и разб. щелочью. Легко превращается в З -фосфат панкреатической рибонуклеазой и в смесь 2 - и З -фосфатов разб. кисл. и щел. [c.87]

Сказанное можно пояснить на примере фермента, активный центр и механизм действия которого достаточно хорошо изучены и который будет ниже детально рассматриваться, — панкреатической рибонуклеазы. Этот фермент катализирует двустаДийный гидролиз фосфодиэфирных связей в РИК, сходный в общих чертах со щелочным гидролизом этих связей. На первой стадии происходит внутримолекулярная атака атома Р на 2 -011-группу примыкающего со стороиы 3 -кислородного атома остатка рибозы с образованием циклического 2, 3 -<1)осфата и разрывом межнуклеотидноП связи. Во второй стадии происходит гидролиз пятичленного фосфодиэфирного цикла. На примере одного из простейших субстратов рибонуклеазы — уридили.п(3 — 5 )аденозина — процесс можно записать в виде [c.200]

Ферменты, как правило, работают в определенном диапазоне pH и. чарактери-зуются некоторым оптимальным значением pH, при котором при прочих равных условиях скорость реакции имеет наибольшее значение. Причины такого характера зависимости можно пояснить на примере кинетики гидролиза цитидин-2, 3 -фосфата, катализируемого панкреатической рибонуклеазой. Как следует из рис. 60, изображающего активный центр фермента на второй стадии реакции расщепления РНК, каталитически активной является форма фермента, у которой остаток имидазола, принадлежащий Н1з-12, протонирован и способен подать протон на атом 2 -0 циклофосфааного фрагмента, а остаток имидазола, принадлежащий Н18-119, не протонирован и способен принять протон у атакующей 212 [c.212]

Панкреатическая рибонуклеаза катализирует гидролиз фосфодиэс )ирных связей РНК по двустадийному механизму с образованием промежуточного соединения — цикли-ческого-2, 3 -фосфата [см. уравнение ( 1.1)]. [c.228]

Используя значения рА для участвующих в катализе остатков гистидина, определите, при каком значении pH ( щах для панкреатической рибонуклеазы достигает максимального значения и в каком интервале значений pH К ах уменьитется не больше чем на [c.229]

Функции различных типов РНК-аз и ДНК-аз в клетке разнообразны. Так, панкреатическая рибонуклеаза (РНК-аза I) обладает экзо- и эндонуклеазным действием и катализирует деградацию всех типов РНК. Вместе с тем известны высокоспецифичные тканевые РНК-азы, расщепляющие фосфодиэфирную связь в области строго определенных нуклеотидных последовательностей и участвующие в созревании первичных транскриптов рибосомальных и транспортных РНК. [c.424]

В блочном методе определения последовательности нуклеиновых кислот весьма существенна методология структурного анализа. В одном из возможных вариантов используется полное расщепление полинуклеотидной цепи двумя (или более) ферментами с различной специфичностью. В случае РНК это может быть осуществлено различными рибонуклеазами, например гидролиз последовательно рибонуклеазой Т,, а затем — панкреатической рибонуклеазой. Структуры полученных олигонуклеотидов сравниваются для поиска перекрывающихся последовательностей Если это оказывается недостаточным, используется третья РНаза. [c.314]

Следующим примером является одностадийное выделение пептидов, несущих аффинную метку, из активного центра нук-леазы стафилококка и панкреатической рибонуклеазы [49]. [c.416]

Этот новейший метод нашел применение при выделении панкреатической рибонуклеазы цыпленка на фосфоцеллюлозе [35] и фруктозо-1,6-дифосфатазы печени кролика на карбоксиме-тилцеллюлозе [36]. Эффективность этого метода видна из следующего примера при очистке глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы путем элирования фермента с СМ-сефадекса 2 мМ раствором глюкозо-6-фосфата выход фермента составил 91%, а удельная активность увеличилась в 51 раз [37]. [c.10]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология