Инактивация ферментов органическими растворителям

Большинство ферментов являются лабильными белками. При переводе их в экстракт они лишаются своего естественного (в клетке) окружения и легко подвергаются денатурации и инактивации под влиянием различных факторов. В связи с этим при выделении и очистке ферментов необходимо соблюдать целый ряд предосторожностей. Как правило, все операции следует проводить при 2—4° С (лучше — в холодной комнате), а фракционирование органическими растворителями — при температуре ниже О С. [c.196]

В присутствии органических растворителей при комнатной температуре больщинство ферментов инактивируются. Поэтому фракционирование проводят при сильном охлаждении Низкая температура не только предохраняет фермент от инактивации, но и усиливает осаждающее действие органического растворителя. [c.201]

Культуральную жидкость (после глубинного метода) или экстракт (после поверхностного культивирования) концентрируют в вакуум-выпарных установках (при этом может происходить инактивация ферментов). Концентрирование растворов ферментов осуществляют также с помощью ультрафильтрации (на полых волокнах или на мембранных фильтрах), что существенно уменьшает потери по сравнению с выпарными методами. Из водных растворов ферменты осаждаются с помощью органических растворителей или солей. Сухие ферментные препараты получают в результате распылительного высушивания (что также сопровождается инактивацией). [c.111]

После осаждения ферментов сернокислым аммонием электродиализ не следует применять, так как происходит значительное снижение pH, что может привести к инактивации ферментов. Повышение pH экстракта ферментов до 8,2—8,6 вызывает образование изоэлектрического состояния многих неактивных белковых соединений, уменьшающее устойчивость с последующим выпадением их в осадок, что повышает степень чистоты ферментных препаратов, получаемых осаждением органическими растворителями. Добавление в раствор ионов кальция приводит к созданию мостичных связей или комплексных соединений, что способствует образованию разветвленных агрегатов. [c.79]

Следовательно, уменьшение притяжения активных групп фермента к молекулам воды обусловлено главным образом снижением диэлектрической постоянной среды. Отметим, что это положение справедливо лишь для водных растворов органических растворителей, не вызывающих инактивирования ферментов. Метиловый спирт, например, диэлектрическая постоянная которого равна 35,4, вызывает в водном растворе значительную инактивацию амилолитических ферментов, в связи с чем его не следует применять для осаждения амилолитических ферментов. [c.126]

Осаждение органическими растворителями вызывает частичную инактивацию ферментов, которая будет зависеть как от продолжительности контакта с органическим растворителем, так и от температуры. Повышение температуры вызовет увеличение кинетической энергии белковых молекул, способствующее лучшему контакту ионогенных групп с органическим растворителем, что может привести к изменению конформации активного центра, проявляющемуся в уменьшении ферментативной активности. Понижение температуры белкового раствора повлечет за собой уменьшение растворимости белков (ферментов). [c.131]

С целью уменьшения степени инактивации ферментов их осаждение следует проводить при охлаждении вытяжки и органического растворителя (спирта или ацетона) до О—2°С и при оптимальном значении pH. [c.131]

Необходимо отметить, что степень инактивации ферментов зависит также и от степени их очистки. Чем меньше степень очистки, тем меньше и инактивация фермента, так как белковая молекула неочищенного фермента защищена поверхностноактивными веществами, обладающими полярностью, средней между полярностью белковой молекулы и водного раствора органического растворителя. Это способствует взаимодействию защитного слоя с раствором органического растворителя и тем самым предотвращает его взаимодействие с молекулой фермента. Как установил П. А. Ребиндер, адсорбция на границе двух [c.131]

В другом варианте метода раствор липида в органическом растворителе наслаивают на поверхность водного раствора фермента, после чего органический растворитель удаляют путем испарения в токе инертного газа, а образовавшуюся липидную пленку диспергируют в водном растворе. Недостаток этого способа состоит в том, что контакт с органическим растворителем может вызвать инактивацию фермента. [c.71]

Биологическая активность фермента в ходе хроматографии может измениться (как уменьшиться, так иногда в возрасти) в силу ряда дополнительных причин. Например, кажущееся увеличение активности фермента может быть результатом его отделения от протеаз. Снизиться активность может как в результате истинной денатурации илп окисления 8Н-групп белка, так и при отделении апофермепта от кофакторов. Иногда инактивация обусловлена разъединением двух или нескольких последовательно работающих ферментов. Такого рода кажущиеся инактивации могут быть обнаружены при объединении хроматографических фракций, когда активность фермента восстанавливается. Для сохранения биологической активности липофильных белков мембран в элюент иногда приходится добавлять спирт или ацетон. При этом может возникнуть определенная неравномерность распределения органического растворителя между жидкостью внутри и снаружи гранул — ионы сорбента, гидратируясь, оттягивают на себя воду. Следствие этой неравномерности — наложение на ионный обмен эффекта распределетельной хроматографии. Для сохранения биологической активности ферментов в элюент часто добавляют глицерин (до 25%) или этиленгликоль (до 5%). [c.292]

Гидрофильные свойства нерастворимых носителей желательны не только потому, что необходимо свести к минимуму неспе-цифическую сорбцию и инактивацию, но также и потому, что на носителях с гидрофобными свойствами может уменьшаться стабильность некоторых связанных ферментов в результате денатурации, аналогичной той, которая вызывается органическими растворителями. [c.177]

Присутствие органических растворителей является помехой при определении активности почти всех ферментов. Поэтому при осаждении фермента растворителем (спиртом, ацетоном, диоксаном и т. п.) активность следует контролировать только после отделения осажденного белка, его растворения и удаления остатков спирта, ацетона и т. п. По сравнению с фракционированием в растворах солей обработка органическими, легко летучими веществами, имеет то преимущество, что получение готового препарата и его высушивание может быть вьшолнено сразу, без предварительного диализа растворов, а следовательно, без разбавления и частичной (дополнительной) инактивации, которые часто сопутствуют диализу. [c.146]

Обнаружено, что ферменты, состоящие из нескольких субъединиц, значительно менее устойчивы в водно-органических смесях по сравнению с ферментами типа каталазы и пероксидазы, состоящими из одной полипептидной цепи. Необратимая инактивация ферментов, состоящих из нескольких субъединиц, вероятно, обусловлена неполной реассоциацией предварительно диссоциировавших субъединиц при возвращении системы к нормальным условиям. Процессы диссоциации и реассоциации субъединиц, происходящие под. влиянием органического растворителя. и гари замораживании, могут приводить к образованию полимерных форм, не обладающих ферментативной активностью. Так, замораживание растворов двух злектрофоретически индивидуальных форм лактат-дегидрогеназы, а затем их последующее плавление в присутствии хлорида натрия приводит к образованию пяти различных форм. Органические растворители, такие как этиленгликоль, пропилен-гликоль, глицерин или диметилсульфоксид, при их добавлении в растворы полностью ингибируют образование этих форм и, за исключением пропиленгликоля, способствуют сохранению ферментативной активности [626, 627]. Как правило, растворимость веществ, включая ферменты и субстраты, уменьшается при понижении температуры и при введении органических растворителей. Несмотря на это, для обнаружения промежуточных соединений при низких температурах часто бывает достаточно не очень больших концентраций субстратов, поскольку при понижении температуры увеличиваются стационарные концентрации [615, 628]. Необходимо, однако, проверять, являются ли обнаруженные при низких температурах промежуточные соединения теми же самыми, что и при нормальных условиях, так как направление процесса может измениться. Активность ферментов, которые находятся в биомем- ранах и связаны е липидами, падает при переводе их в водные буферные растворы. Например, известно, что цитохром Р-450 ин-активируется при экстракции в водные растворы (при этом наблю- [c.237]

Допустим, что перед исследователем стоит задача определить природу дефекта у мутантной мыщи, синтезирующей аномально низкое количество альбумина (белка, который в норме секретируется в кровь клетками печени в значительных количествах). Для этого прежде всего необходимо взять образцы ткани печени у дефектных и нормальных мыщей (последние служат в качестве контролей) и обработать клетки сильным детергентом для инактивации клеточных нуклеаз, которые в противном случае могут разрушить нуклеиновые кислоты. Затем отделяют РНК и ДНК от всех других компонентов клетки присутствующие белки при этом полностью денатурируются, их удаляют последовательной экстракпией фенолом - мощным органическим растворителем. Нуклеиновые кислоты остаются в водной фазе. Чтобы их отделить от низкомолекулярных клеточных соединений, проводят осаждение спиртом. После этого ДНК отделяют от РНК, пользуясь их различной растворимостью в спиртах и обрабатывают высокоспецифическими ферментами (соответственно РНКазой или ДНКазой), чтобы освободиться от нежелательных примесей нуклеиновых кислот. [c.239]

Некоторые ферменты необыкновенно устойчивы к инактивации, вызываемой любым из факторов, описанных в разд. 6.2. Часто это отмечается даже тогда, когда процедура очистки продолжается в течение нескольких недель. Внеклеточные ферменты отличаются большой устойчивостью потому, что 0Н1И существуют в более жестких природных условиях. В таких случаях быстрота операций не имеет большого значения, если решены проблемы протеолитической инактивации. Но в других случаях, когда стабильность фермента не столь велика, скорость опе раций может быть гораздо важнее, чем разрешегаие, достигаемое на каждом этапе, даже если это означает включение дополнительной стадии очистки для окончательного удаления из препарата примесей. При очистке нестабильных ферментов следует исключать диализ и гель-фильтрацию на медленно фильтрующих средах. Если это возможно, то одна стадия фракционирования должна следовать за другой без длительной подготовки. Так, после солевого фракционирования может идти гель-фильтрация, поскольку на этой стадии удаляется соль и в то же время происходит фракционирование белков. Но после солевого фракционирования нельзя сразу же использовать метод ионного обмена. Его можно применять только в исключительных случаях, когда соль, содержащаяся в осадке, не препятствует адсорбции нужного белка. Непосредственно после стадии ионного обмена невозможно использовать гель-фильтрацию, так как фракции нужно сконцентрировать, — очень редко при элюции с ионообменника получается острый пик, содержащий концентрированный раствор данного вещества (см., однако, обсуждение аффинной элюции в разд. 4.4 и х роматофокуси-рования в разд. 4.3). После фракционирования смеси с помощью органического растворителя может следовать ионный [c.266]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология