Хромосомная интеграция

Одинаковые IS-элементы и транспозоны, расположенные на разных репликонах, способны обеспечивать гомологичную рекомбинацию, приводящую к образованию коинтеграта. Именно таким путем некоторые плазмиды обратимо встраиваются в хромосому бактерий, что сразу обеспечивает добавление значительного фрагмента генетического материала (рис. 82). Плазмиды, способные встраиваться в хромосому бактерий и вырезаться оттуда, называют эписомами. Иногда вырезание эписомы может происходить не по той паре IS-элементов, по которой прошла интеграция. В этом случае плазмида может захватить часть хромосомного материала, а часть своей ДНК [c.127]

Выделение и клонирование всего хромосомного сайта интеграции или его части. [c.123]

Перенос полученной генетической конструкции хромосомный сайт интеграции/клонированный ген в хозяйскую клетку в составе плазмиды, не способной к автономной репликации в клетках этого хозяина. [c.123]

А. Ген встроен в середину клонированного в плазмиде сегмента аЬ, гомологичного сегменту а Ь в хромосомной ДНК. В результате двойного кроссинговера (Х-Х) клонированный ген оказывается в составе хромосомы. Б. Ген встроен вблизи клонированного в плазмиде сегмента с, гомологичного сегменту с в хромосомной ДНК. В результате одиночного кроссинговера (X) происходит интеграция в хромосому всей плазмиды вместе с включенным в нее геном. [c.124]

Осуществили гомологичную рекомбинацию с помощью двойного кроссинговера между не способным к транспозиции Тп5-элемен-том, несущим ген токсина, и плазмидным транспозоном Тп5 дикого типа, интегрированным в хромосому. В результате интеграции измененный транспозон Тп5 с геном токсина оказался встроенным в хромосомную ДНК, а транспозон Тп5 дикого типа был элиминирован. [c.341]

При трансфекции Е8-клеток в культуре вектором, предназначенным для интеграции в специфический хромосомный сайт, в некоторых [c.422]

В специфический хромосомный сайт Е8-клеток можно не только встроить трансген, кодирующий какую-то новую функцию, но и направленно разрушить этот сайт интеграцией с его кодирующей областью специфической последовательности (обычно селективного маркерного гена) (рис. 19.7). Одна из задач направленного нарущения ( нокаута ) гена состоит в исследовании влияния этого процесса на развитие организма и протекающие в нем физиологические процессы. Кроме того, есть надежда, что трансгенных животных с нарушением в определенном гене можно использовать как модель для изучения болезней человека на молекулярном уровне. [c.425]

Происхождение амплифицированных хромосомных копий объяснить значительно сложнее. HSR состоит из большего числа тандемно повторенных единиц. Одна из трудностей в объяснении их возникновения путем интеграции последовательностей двойных микрохромосом связана с тем, что число хромосомных повторов во много раз больше, чем число повторов в отдельных двойных микрохромосомах. Большое число интегрированных копий является также препятствием при создании моделей для строго внутрихромосомного события амплификации. [c.498]

Поскольку ретровирусная инфекция обычно приводит к интеграции единственной копии вирусного генома в ДНК клетки-хозяина, ретровирусные векторы, несущие чужеродные гены, могут выполнять роль уникальных генетических маркеров индивидуальных хромосом в экспериментах по гибридизации соматических клеток, хромосомному переносу генов, а также в исследованиях рекомбинационных процессов [9]. [c.273]

Интеграция хроматиновых волокон в хромосомную структуру [c.119]

Показано, что геном ретровируса состоит из одноцепочечной РНК. Он включает следующие информационные последовательности (от 5 - к 3 концу) 5 -регулятор-ную последовательность гены, кодирующие белки, необходимые для формирования внутренней структуры ген обратной транскриптазы гены поверхностных гликопротеинов З -регуляторную последовательность. Как только вирусная частица проникает в клетку, обратная транскриптаза осуществляет синтез двухцепочечной ДНК-копии одноцепочечной РНК. Затем ДНК-копия встраивается в хромосомную ДНК клетки интеграция может происходить во многих сайтах генома хозяина. Эта ДНК вызывает в клетке синтез новой вирусной РНК и белков, необходимых для синтеза новых вирусных частиц. [c.214]

Хромосомную карту Е.соИ можно получить, если смешать клетки Hfr и р- и дать возможность конъюгации происходить в течение опре-деленного интервала времени, а затем клетки интенсивно перемешать, например, в гомогенизаторе Уоринга. В результате этой процедуры все конъюгационные мостики разрушаются и процесс спаривания бактерий прерывается. Спаривание прерывают через разные промежутки времени и определяют наличие в бактериях-реципиентах генов, перенесенных иа Клеток донорного штамма. При помощи этого метода было показано,, что для полного переноса хромосомы при 37 °С требуется приблизительно 100 мин и что локализацию любого гена в хромосоме можно приблизительно установить по времени, необходимому для переноса этого гена в клетку-реципиент. В действительности, однако, все выглядит несколька сложнее. Поскольку полный перенос всей хромосомы осуществляется редко, в опытах обычно используются разные подштаммы Е. соИ К-12, У которых фактор F расположен в разных местах во всех случаях гены,, локализованные по часовой стрелке сразу же за точкой интеграции (рис. 15-1), переносятся быстро и с высокой частотой. [c.191]

Если клетка трансформирована нереплици-рующейся плазмидой, несущей клонированный ген в середине клонированного фрагмента с хромосомным сайтом интеграции, то может произойти спаривание между гомологичными нуклеотидными последовательностями плазмиды и хозяйской ДНК (рис. 6.15, А) и далее интеграция в результате двойного кроссинговера, осуществляемого ферментами клетки-хозяина. Альтернативный вариант — интеграция всей плазмидной ДНК в хромосому хозяина в результате одиночного кроссинговера (на рисунке не показано). Интеграция всей плазмиды может произойти и в том случае, если клонированный [c.123]

В. subtilis в составе плазмиды, включали в хромосомную ДНК с помощью рекомбинации, заменив им маркерный ген. Отбирали клетки, которые уже не экспрессировали маркерный ген, т. е. несли вместо него ген-мищень, интегрированный в хромосомную ДНК. Для интеграции других копий гена-мищени в хромосомную ДНК хозяйской клетки повторяли эту процедуру, используя другие несущественные области ДНК. [c.126]

К счастью, правильно спланировав эксперимент, можно минимизировать влияние метаболической перегрузки, оптимизировать выход рекомбинантного белка и повысить стабильность трансформированных хозяйских клеток. Например, нагрузку можно снизить, если использовать малокопийные плазмидные векторы. А еще лучше вообще отказаться от векторов и встроить чужеродную ДНК в хромосомную ДНК организма-хозяина. В этом случае не нужно заботиться об обеспечении стабильности плазмиды. Кроме того, клетке не приходится расходовать свои ресурсы на синтез ненужных продуктов, кодируемых маркерными генами устойчивости к антибиотикам. Синтез продуктов таких генов, входящих в состав плазмидных векторов наряду с генами-мишенями, является одной из основных причин метаболической перегрузки. Интеграция в хромосому особенно важна в тех случаях, когда используется сам рекомбинантный микроорганизм, а не синтезируемый им продукт. Уменьшению метаболической перегрузки помогает также применение сильных, но регулируемых промоторов. В таких случаях ферментацию проводят в две стадии. На первой из них, во время роста, промотор, контролирующий транскрипцию гена-мишени, выключен, а на второй, во время индукции, -включен. [c.128]

Если вектор представляет собой плазмиду, реплицирующуюся независимо от хромосомы, то он должен содержать сайт инициации репликации, функционирующий в хозяйской клетке. Если же вектор предназначен для встраивания в хозяйскую хромосомную ДНК, то для обеспечения рекомбинации он должен нести последовательность, комплементарную определенному участку хромосомной ДНК хозяина (хромосомный сайт интеграции). Поскольку технически многие операции с рекомбинантными ДНК сложнее проводить в клетках эукариот, чем прокариот, большинство эукариотических векторов сконструированы как челночные. Другими словами, эти векторы несут два типа сайтов инициации трансляции и два типа селективных маркерных генов, одни из которых функционируют в Es heri hia oli, а другие — в эукариотических хозяйских клетках. Такие векторные системы экспрессии разработаны для дрожжей, насекомых и клеток млекопитающих. [c.136]

Рис. 17.9. Схематическое представление Т-ДНК, входящей в состав вектора. После интеграции Т-ДНК в хромосомную ДНК растения транспозаза может вырезать селективный маркерный ген и встроить его в другой хромосомный сайт. Обозначения Л и П — левая и правая фланкирующие последовательности, Ве — мобильный элемент. Промоторы и сигналы терминации транскрипции гена транспозазы, гена, интересующего исследователя, и селективного маркерного гена не показаны.

Для обеспечения экспрессии чужеродньгх генов, введенных в растительные клетки, использовали растительные промоторы. Различные промоторы, функционирующие только в определенньгх растительных тканях или на определенной стадии развития растения, идентифицировали по экспрессии репортерного гена без промотора после его интеграции в хромосомную ДНК растения. Были разработаны методы встраивания чужеродных генов непосредственно в хлоропластную или митохондриальную ДНК так, чтобы кодируемый белок синтезировался прямо в этих органеллах. И наконец, для того чтобы успокоить общественность, были разработаны методы удаления маркерных генов из трансгенных растений. [c.387]

В опытах по трансфекции массу добавленной к реципиентным клеткам ДНК обычно увеличивают за счет избытка ДНК-носителя, препарата какой-то другой ДНК (например, ДНК спермы лосося). Доказано, что трансфицируемые клетки получают ДНК-носитель в виде последовательностей, фланкирующих селектируемые с каждой стороны. Следовательно, трансфекция осуществляется структурой ДНК, состоящей из ряда сцепленных последовательностей всех типов, присутствующих в препарате донора. Поскольку ревертанты по селектируемому маркеру утрачивают весь этот материал, кажется вероятным, что трансфицируемые клетки приобретают только одну такую структуру ДНК. Данная структурная единица может образовываться благодаря конкатемерному сцеплению донорных последовательностей в ходе реакции, которая проходит очень быстро по сравнению с другими событиями, вовлекаемыми в процесс трансфекции. Такая трансфицируемая единица может иметь протяженность около 1-10 п.н. Мы не можем установить с помощью метода гибридизации, сцеплена ли донорная единица с хромосомной ДНК реципиента (интересующие нас концевые фрагменты представлены в слишком незначительных количествах). Вероятно, что первая стадия процесса заключается в образования нестабильных внехромосомных единиц, которые впоследствии стабилизируются в результате интеграции. В некоторых клеточных линиях методом гибридизации in situ было показано, что трансфицированные клетки содержат донорный материал, интегрированный в хромосомы хозяина. Любая определенная клеточная линия имеет только один сайт интеграции однако сайты в каждой линии различны. Вероятно, выбор сайта для интеграции - случайное событие иногда оно связано с большими хромосомными перестройками. [c.500]

Инсерционные последовательности. Различные последовательности нуклеотидов, обнаруженные в бактериях и способные к перемещению из одного хромосомного локуса в другой. Спонтанное перемещение таких последовательностей может вызывать мутации в исходном или новом участке внедрения. Эти последовательности могут нести активные промоторы или терминаторы синтеза мРНК и служить участками-мишенями для интеграции эписом. [c.308]

Специфическая трансдукция облегчает генетические исследования у бактерий, касающиеся, в частности, расположения и регуляции генов. Для Е. соИ существует множество фагов, подобно фагу Я включающихся в хромосому бактерии в разных местах и позволяющих осуществлять специфическую трансдукцию хромосомных маркеров. Очень важно при этом, какой используется донор-хозяин. Например, штамм 2 (табл. 14.1) имеет делецию в месте нормальной интеграции профага Я в этом случае фаг Я включается с низкой частотой в другие, несвойственные для него места, разбросанные по всей хромосоме. Индукция таких лизогенных бактерий приводит к формированию трансдуцирующих фагов, несущих почти любой желаемый ген [35]. Этот подход может быть использован и для других фагов Е. oli, осуществляющих специфическую трансдукцию, а также для фагов, размножающихся в других видах бактерий. Многие из методов, позволяющих реализовать эти подходы и другие возможности использования фагов, способных к специфической трансдукции, описаны Миллером [2]. [c.90]

OM ОНИ способны передавать лишь с низкой частотой. Все хромосомные маркеры донора F+ передаются с примерно одинаковой частотой (около 10" на одну донорную клетку для любого маркера), и большинство образовавшихся трансконъюгантов наследует фактор F. Доноры Hfr передают хромосому направленно и последовательно начиная с генетически фиксированной точки, зависящей от места интеграции фактора F в бактериальной хромосоме. С самыми высокими частотами передаются те генетические маркеры, которые находятся вблизи точки начала переноса Hfr-хромосомы по мере удаления маркеров от этой точки частота их переноса и наследования пропорционально уменьшается. Такая картина наблюдается вследствие спонтанного случайного прекращения передачи хромосомы. За исключением редких случаев достаточно длительной конъюгации, когда возможен перенос всей Hfr-хромосомы, большинство трансконъюгантов, унаследовавших хромосомный материал Hfr, сохраняет генотип F , так как части интегрированной F-плазмиды передаются последними в качестве замыкающих маркеров. [c.102]

Интеграция — результат рекомбинации между гомологичными последовательностями плазмидной ДНК и хромосомы клетки-хозяина. Интегрированная копия плазмидного вектора оказывается фланкированной прямыми повторами дупликации подвергается участок взаимной гомологии плазмидной и хромосомной ДНК- Рис. 7.2 иллюстрирует рекомбинационные события в области гена leu ine 2. У многих трансформантов наблюдается множественная интеграция плазмид в виде тандемно повторяющихся копий (рис. 7.2). Часть интегративных рекомбинационных событий происходит как двойной кроссинговер. Эта схема может привести к замещению участка хромосомной ДНК на гомологичный участок плазмидной ДНК без интеграции векторной части рекомбинантной плазмиды. Интеграция может произойти Б любом месте генома при условии, что в этом месте находится последовательность, гомологичная участку плазмидной ДНК-Единственное исключение составляет геномный сайт плазмидного селективного маркера. [c.213]

Рис, 7,2. Возможные варианты интеграции плазнид. Результатом одиночного рекомбинационного события является единичная интегрированная копия векторной последовательности, ограниченная прямыми гомологичными повторами (а), или же множественные тандемно организованные копии вектора (б). Двойной кроссинговер приводит к замещению хромосомной ДНК гомологичными последовательностями рекомбинантной плазмиды, не сопровождающемуся интеграцией векторных последовательностей (в). [c.214]

Реципрокная транслокация выявлена у некоторых пациентов с лимфомой Беркитта — быстрорастущей опухоли В-лимфоцитов человека (рис. 57.5). Эта транслокация иллюстрирует механизм активации потенциальных клеточных онкогенов. В транслокации участвуют хромосомы 8 и 14. Фрагмент хромосомы 8, присоединяющийся к хромосоме 14, содержит ген туе. Как показано на рисунке 57.6, в результате такого перемещения (транспозиции) неактивный ген попадает под контроль энхансера, усиливающего транскрипцию генов, кодирующих тяжелые цепи иммуноглобулинов. В результате ген туе активируется. По-видимому, синтез больших количеств ДНК-связывающего белка, кодируемого геном туе, вызывает малигнизацию клеток, возможно влияя на регуляцию митозов. Этот механизм сходен с механизмом вставки энхансера, однако в рассматриваемом случае хромосомная транслокация (а не интеграция провируса) ставит протоонкоген (в данном случае туе) под контроль энхансера. [c.360]

С появлением методологии генной инженерии метод локализованного мутагенеза становится доступным для широкого круга микроорганизмов. В наиболее простом варианте клонированный фрагмент ДНК, ограниченный удобными сайтами рестрикции, может быть выделен и подвергнут мутагенезу in vitro. Вследствие проведения реакции in vitro дозы мутагена могут быть достаточно высокими, что сильно повышает частоту мутагенеза. Такой подход использован при создании штамма-продуцента гомосерина (см. гл. 4). Для получения стабильных неревер-тирующих мутаций в определенном гене можно применить метод инсерционного локализованного мутагенеза. С этой целью инактивируемый ген клонируют на плазмиде и встраивают в него детерминант устойчивости к антибиотику (рис. 29). Затем компетентные клетки трансформируют сконструированной гибридной плазмидой (или полученной при ее расщеплении линейной молекулой ДНК), содержащей указанный детерминант, фланкированный последовательностями, гомологичными хромосомному гену. В результате двойного кроссинговера происходит интеграция гена лекарственной устойчивости в гомологичный район хромосомы. Искомые трансформанты отбирают на селективных [c.160]

Смотреть страницы где упоминается термин Хромосомная интеграция: [c.71] [c.71] [c.128] [c.128] [c.123] [c.124] [c.124] [c.137] [c.141] [c.143] [c.338] [c.345] [c.424] [c.564] [c.31] [c.232] [c.233] [c.51] [c.153] [c.82] [c.104]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология