АТФазы определение активности

Реактивы для определения активности Са—АТФазы. [c.363]

Важным фактором, оказывающим влияние на гидролазную активность, является АДФ — продукт АТФазной и субстрат АТФ-синтетаз-ной реакции. В определенных концентрациях АДФ ингибирует гидролиз АТФ по простому конкурентному типу торможения. Действие АДФ очень специфично. Только АДФ является ингибитором гидролиза АТФ и других НТФ. Известны активаторы АТФазы, действие которых обусловлено снятием торможения, вызванного АДФ. К таким активаторам относится, например, сульфит-ион. [c.474]

Для определения константы скорости инактивации Са—АТФазы НБД-хлоридом проводят модификацию 5Н-групп в той же среде, которая используется для определения кинетических характеристик 5Н-групп (с. 360). Реакцию начинают добавлением НБД-хлорида. По ходу реакции каждые 0,5—5 мин в зависимости от условий реакции отбирают аликвоты объемом 20—50 мкл и вносят их в 1 мл среды для определения активности Са—АТФазы (с. 359). Пробы инкубируют 1— [c.363]

Примечание. Для определения активности АТФазы при pH почвы вместо буферного раствора добавляют дистиллированную воду. [c.343]

На рис. 1—3 изображены результаты опытов по изучению влияния тритона Х-100, трис-дезоксихолата, додецилсульфата натрия и дигитонина на Mg " -, Na -, К -АТФазную активность во фракциях микросом, миелина и синаптосом, предварительно инкубированных с различными концентрациями этих детергентов в течение 30 мин. при 4—5° С. Все исследованные ПАВ в определенных концентрациях активируют Mg -, Na" -, К " -АТФазу во всех трех фракциях. [c.119]

В данной схеме предполагается, что насосы, восстанавливающие исходный ионный гомеостаз в проводящих тканях после ПД, являются в основном Н -АТФазами паренхимных клеток проводящих тканей. Это подтверждает в определенной степени установленный факт увеличения общей АТФазной активности гомогената проводящих тканей стебля тыквы через 1 —3 мин после генерации ПД (177]. Такой эффект известен и для ритмически возбуждаемых животных тканей (мышца, нерв). Он может быть связан с биосинтезом новых молекул фермента под влиянием возбуждения или переходом неактивных форм фермента в активные [148]. [c.179]

Распространенные методы изучения функциональной активности Na" , K -АТФазы основаны на определении количества не-о.рганического фосфата, содержаш егося в исследуемом растворе. Суш ествуют различные методы обнаружения фосфата в биообъектах. Но все они основаны на том, что в кислой среде молибде- [c.241]

Значения Ка для АТФ, рассчитанные из величины защитного эффекта, соответствуют величинам Кт для этого субстрата. Ка для АДФ имеет сходную величину. В ходе этих экспериментов обнаружилась определенная связь между скоростями модификации-5Н-групп фермента НБД-С1 и ингибированием его активности ингибирование фермента протекает в четыре раза быстрее модификации его 5Н-групп, из чего следует, что модификация 5Н-групп одной молекулы белка способна выключить из работы четыре молекулы фермента. Этот факт отражает олигомерную природу Са-АТФазы. АТФ, замедляя модификацию 5Н-групп НБД-С1, одновременно уравнивал константы инактивации и модификации фермента так, что они составляли в его присутствии величины одного порядка. Это позволяет полагать, что АТФ нарушает взаимодействие молекул в олигомерном ансамбле. В его присутствии из работы выводится ровно то количество молекул фермента, которое было модифицировано реагентом. [c.95]

Следовательно, должно быть равно Ю з. Величина кз, рассчитанная нами с использованием экспериментально определенных Ка и Л з, равна 10 -М мин- [50], т. е. близка к верхнему пределу констант скоростей образования специфических комплексов фермента с лигандами 65,66]. Поэтому предположение об увеличении скорости связывания АДФ под действием АТФ мало вероятно. Гораздо более естественной кажется возможность, согласно которой ускорение диссоциации АДФ, вызванное АТФ, обусловлено медленным гидролизом АТФ в активном центре фермента. АТФ-зависимая активация АДФ-блокированной АТФазы тогда может быть представлена следующей схемой [c.34]

Определенный биологический смысл имеет, видимо, то обстоятельство, что Н-АТФаза внешней мембраны характеризуется оптимумом pH между 6 и 7. При pH выше 7,0 активность фермента резко падает. Создается впечатление, что Н+-АТФаза, откачивая ионы Н+ из цитоплазмы, используется клеткой, чтобы предотвратить закисление внутриклеточного объема. Вероятно, регуляция внутреннего pH есть одна из функций Н+-АТФазы плазмалеммы. В то же время очевидна и другая функция этого фермента образуемая им Др-Н используется для концентрирования в клетке различных веи еств, которые транспортируются туда вместе с протонами (см. разд. 5.2). [c.125]

Аликвоту фильтрата помещают в мерную колбу на 50 см Дальнейшее определение содержания Р2О5, отщепившегося от субстрата под действием фосфатаз, ведут после окрашивания по Дениже (см. определение активности АТФазы). [c.346]

Поскольку Ыа+К -АТФаза локализована на поверхностях мембран и даже, возможно, является их структурным компонентом, не удивительно, что активность этого фермента зависит от наличия фосфолипида. Присоединение фосфолипида в определенном количественном соотношении к белку ведет к переходу фермента из неактивной формы в полностью активную форму. У разных организмов и в разных тканях активаторами, вероятно, могут служить различные фосфолипиды в солевой железе морских птиц это, по-видимому, не фосфолипид, а сульфатид (рис. 47). [c.145]

Как показали тщательные исследования Холмса и его сотрудников, перечисленным выше событиям предшествует активация синтеза РНК в солевой железе. Полученные данные дают основание думать, что увеличение размеров железы и специфической активпостп транспортной системы обусловлено образованием de novo соответствующих компонентов и, следовательно, зависит от предшествующего синтеза определенных информационных РНК. Насколько можно судить по имеющимся данным, никаких новых компонентов не образуется — возрастает лишь количество тех, которые уже были в железе. По-видимому, особенно активно идет транскрипция той части генома, которая кодирует структуру существенных полипептидных субъединиц Na+K -АТФазного комплекса, и это ведет сначала к увеличению количества соответствующей информационной РНК, а затем и концентрации самого фермента. Одновременно возрастает количество гликолипида, необходимого для Na+K -АТФазы. [c.160]

Изученггые надш ПАВ — тритон Х-100, трис-дезоксихолат, додецилсульфат натрия и дигитонин — в определенных концентрациях вызывают активирование Mg -, Na -, К -АТФазы. Степень активирования максимальна в микросомной фракции и миелине и минимальна в синаптосомах. Концентрация ПАВ, необходимая для максимальной активации Mg " -, Na+-, К -АТФазы, в синаптосомах ниже концентрации, обусловливающей активацию фермента в других мембранных структурах. Активирующее действие ПАВ проявляется тогда, когда они находятся в молекулярно-диснерсном состоянии. Полученные данные показывают, что существует определенная специфика внутримембранной организации Mg +-, Na+-, К+-АТФазного комплекса в различных клеточных структурах, обладающих этой активностью. [c.125]

Поверхностно-активные вещества — тритон Х-100, трис-дезоксихолат, додецилсульфат натрия и дигитонин — в определенных условиях (концентрация, время воздействия) обусловливали активирование Mg +-, Na+-, К+- АТФазы фракции микросом, миелина и синаптосом, выделенных из мозга кролика. Степень активирования ферментативной активности была значительно более выражена на микросомной фракции и миелине, чем на синаптосомах. Концентрация детергентов, необходимая для максимальной активации Mg +-, Na+-, К+-АТФазы в синаптосомах, была меньше концентрации, оСусловливаюшей активацию фермента в других мембранных структурах. Путем исследования критической концентрации мицеллообразования разных детергентов и сравнения этой величины с активирующими ферментативную систему концентрациями, сделано заключение, что активирующее действие детергентов проявляется при их молекулярно-дисперсном состоянии. Полученные данные свидетельствуют о наличии определенной специфики внутримембранной организации Na+-, [c.212]

Именно с этими представлениями согласуются результаты Дж. Бойера. Элементарный акт образования АТФ может происходить в активном центре Н+-АТФазы в условиях деэнергизации мембраны, когда A[iH+ = О, и даже в активном центре изолированного фактора F, находящегося в растворе. Однако валовой синтез АТФ при деэнергизации практически не происходит. Изучение реакций изотопного обмена 0 (АТФ Н2 0) показало, что стадией, определяющей крайне низкую скорость валового синтеза АТФ в отсутствие АрН , является освобождение синтезированного АТФ из активного центра (Boyer Р. D.). Именно этот процесс ускоряется (в 1000 раз) при энергизации мембраны. Таким образом, энергия АрН+ используется в основном для вытеснения прочносвязанного АТФ из каталитического центра фермента. Энергия также расходуется и при связывании ферментом фосфата и АДФ, причем каталитические центры функционируют, чередуясь в определенном порядке. Все это означает, что энергия АрН+ расходуется не на стадии элементарного акта образования ковалентной связи АДФ Ф в активном центре фермента, а влияет на процессы связывания ферментом субстрата и освобождения продукта реакции из активного центра. [c.221]

ДЦКД и ДЭС может быть обусловлено не только подавлением активности Н+-АТФазы плазмалеммы, но и в определенной степени угнетением клеточного метаболизма в целом [3481. В свою очередь, протонофоры способны снижать электрогенную компоненту как [c.37]

Определенную проблему при этом составляет выбор рабочих концентраций ингибиторов Н -АТФазы. Дело в том, что использование низких концентраций ингибиторов, позволяющих достаточно однозначно судить об их влиянии на Ер путем угнетения активности №-АТФазы [3481, в опытах in vivo далеко не всегда оказывается эффективным. Снижение Ер в зтих условиях обычно составляет менее ЗОХ от исходного уровня, что дает возможность лишь тестировать участие Н+-АТФазы в работе протонного насоса (1861. Особенно неэффективен в опытах in vivo, судя по некоторым данным [186, 354, 6721, ванадат, являющийся, по-видимому, наиболее специфическим ингибитором Н -АТФазы плазмалеммы из числа известных на сегодняшний день [356, 5071. Это обстоятельство нередко заставляет исследователей идти на увеличение рабочих концентраций ингибиторов в ущерб избирательности их действия на Н -АТФазу плазмалеммы. При использовании высоких концентраций ингибиторов Н -АТФазы угнетение Ер достигает 50Х и более. Поскольку такое значительное угнетение Ер оказывается сопоставимым по величине с угнетением Ер в присутствии, например, протонофора КЦХФГ [2151. можно заключить, что Н -АТФаза плазмалеммы. выступая в качестве электрогенного протонного насоса, вносит по меньшей мере определяющий вклад в формирование / интактных клеток высших растений. [c.38]

Транспортные АТФазы, функция которых заключается в энергетическом обеспечении активного транспорта ионов, в нативной мембране также представлены олигомерными конструкциями. Это было достоверно показано с помощью метода радиоинактивации (метод молекулярной мишени). Принцип его заключается в определении кинетики инактивации фермента в нативной мембране после ее облучения потоком высокоэнергетических электронов. Используя эмпирическое уравнение зависимости скорости инактивации от дозы радиации (она пропорциональна размерам функциональной единицы фермента в мембране), можно найти эти размеры и соотнести их с молекулярной массой протомера. Для Ыа, К-АТФазы получено, что фермент в мембране представляет собой молекулярную мишень, по крайней мере вдвое превышающую размеры молекулы. Аналогичные результа- [c.49]

Особенно важен анализ влияния Е на процессы первичного активного транспорта, которые играют решающую роль в энергизации мембран путем создания соответствующих электрохимических градиентов. Из двух основных систем, обеспечивающих протекание этих процессов — транспортных АТФаз и ЭТЦ. определенные сведения по данному вопросу имеются относительно первой системы. Идея о том. что транспортные АТФазы. являясь электро-генными молекулярными машинами, по принципу обратной связи должны находиться под контролем мембранного потенциала, успешно разрабатывается в последние годы [367]. Однако она еще не получила достаточно полного обоснования. [c.76]

Противоречивые данные получены также при исследовании избирательности связывания белков с различными фосфолипидами. Так, селективность взаимодействия фосфолипидов, несущих определенные полярные группы, была выявлена для родопсина, На+, К -АТФазы из 8диа1из a antus, цитохром-с-оксидазы, Са +-АТФазы. Вместе с тем многочисленные эксперименты по реактивации выделенных мембранных ферментов путем добавления экзогенных липидов и детергентов показали, что в большинстве случаев не существует специфических белок-липидных взаимодействий, обеспечивающих ферментативную активность разные типы липидов могут одинаково влиять на функционирование мембраносвязанных белков. Несмотря на то, что взаимодействие липидов с интегральными белками носит в основном гидрофобный характер, электростатические силы связывания заряженной гидрофильной части белковой молекулы и полярных групп окружающих липидов могут существенно влиять на характер липидного микроокружения белка. Кроме того, для активирующего действия липидов по отношению к некоторым мембранным ферментам важны такие факторы, как степень подвижности ацильных цепей и способность липидов образовывать мицеллы. По-видимому, сродство разных липидных молекул к белкам мембраны определяется не спецификой белков, а спецификой липидных молекул. [c.60]

Определение ферментативной активности Ма , К -АТФазы эритроцитарных мембран после жмдукцжж пероксидного окисления липидов [c.245]

Выделить эритроцитарные мембраны по методике, описанной в лабораторной работе № 1. К 1 мл суспензии эритроцитарных мембран добавить 150 мкл смеси растворов Ре80 (100 мкмоль/л) и аскорбиновой кислоты (2 ммоль/л) и инкубировать 5, 15, 30, 45 и 60 мин при 37 С. Затем провести определение ферментативной активности Ка % К -АТФазы нативных и модифицированных мембран. Параллельно исследовать уровень ТБК-реактивных продуктов пероксидного окисления липидов (см. лабораторную работу № 11). После завершения экспериментов сопоставить динамику изменений величин активности Ка" , К+-АТФазы в процессе развития ПОЛ эритроцитарных мембран и уровня накопленных окисленных продуктов липидов. [c.245]

Постоянная работа сети саркоплазматического ретикулума сердца по созданию более чем 1000-кратного градиента Са + по обе стороны мембраны требует поддержания концентрации АТФ около активного центра АТФазной молекулы на достаточно высоком уровне. Несмотря на то что доля энерготрат, приходящихся на систему кальциевого насоса, от общего потребления энергии сердечной клеткой невелика, в случае полной блокады синтеза АТФ его расщепление ретикулярной АТФазой произошло бы за 1—2 мин. Самый факт локализации ретикулярной сети в непосредственной близости от других структур (миофибриллы), также потребляющих энергию, предполагает, что в определенных участках клетки может наступить истощение фондов АТФ [c.71]

К" -АТФаза, которая транспортирует Ма" из клетки наружу, а — снаружи внутрь клетки. Ма+-насос является машиной, преобразующей энергию макроэргиче-ской связи АТФ в энергию ионных градиентов. Эта машина работает обратимо при разрядке ионных градиентов может синтезироваться АТФ. Это означает, что активный транспорт может идти только до достижения определенного градиента (при градиенте выше этой величины начнется синтез АТФ). Таким образом, даже в [c.32]

Изменение метаболизма может быть связано с fiapymi нием энзиматической активности, наступающим вслед е неизбежным лизисом клеток при препаровке. Некоторь энзиматические изменения более выражены и усилен благодаря разрушению клеточных мембран, представляв щих барьер для проникновения целого ряда веществ. В i же время торможение дыхания, особенно в клеточных су< пензиях, может происходить при высвобождении из кле кй и соответствующем разведении коэнзимов или кофа торов, которые в определенной концентрации имеются норме вымывании и разведении АТФазы и других гидр( литических ферментов, локализованных в интактной кле ке прямом разрушении различных внутриклеточны [c.236]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология