Протонофоры

Дыхательный контроль — это параметр, введенный еще до появления хемиосмотической теории, который позволяет оценить интактность митохондриального препарата. Он определяется как отношение скорости дыхания при максимальном синтезе АТР (т. е. в присутствии ADP )или в присутствии протонофора к скорости дыхания в отсутствие синтеза АТР или протонофора, т. е. [c.93]

Убедительные экспериментальные доказательства в пользу описанного механизма сопряжения дыхания и фосфорилирования были получены с помощью ионофоров. Молекулы этих веществ, как правило, липофильны и способны переносить ионы через мембрану. Например, 2,4-динитрофенол (протонофор) легко диффундирует через мембрану в ионизированной и неионизированной форме, перенося протоны в сторону их меньшей концентрации в обход протонных каналов. [c.177]

Г. Протонофоры разобщают дыхание и фосфорилирование. [c.119]

Какие из последующих утвержцений правильно описывают механизм окислительного фосфорилирования 1) функцией ЦПЭ является перенос электронов через внутреннюю мембрану в митохондриальный матрикс 2) энергия элекгронов, переносимых по ЦПЭ, трансформируется в энергию электрохимического градиента 3) однонаправленный транспорт Н в матрикс митохондрий создает фадиент pH 4) протонофоры разобщают тканевое дыхание и фосфорилирование 5) АТФаза осуществляет транспорт Н" в межмембранное пространство 6) энергия электрохимического градиента используется для синтеза АТФ [c.134]

Так, в случае утечки протонов, катализируемой протонофором, [c.65]

После одиночной вспышки света сдвиг спектра каротиноидов исчезает со скоростью, которая коррелирует со скоростью рассеивания градиента протонов, причем она может резко возрастать при добавлении протонофора. Таким образом, несмотря на то что каротиноиды реагируют на локальные поля в мембране, измерения спектрального сдвига позволяют следить также за спадом трансмембранной разности потенциалов между водными фазами. [c.137]

АТР-зависимые механизмы. Кроме того, Ацн+-зависимые транспорты чувствительны к протонофорам, устойчивы к арсенату (который приводит к исчерпанию АТР в клетке) и требуют [c.172]

Присутствия субстратов дыхания, если АТР-синтетаза инактивирована в результате мутации. Напротив, АТР-зависимые транспортные системы, чувствительные к осмотическому шоку, устойчивы к действию протонофоров, блокируются арсенатом и в мутантных бактериях с неактивной АТР-синтетазой зависят от гликолиза, а не от дыхания. АТР-зависимые транспортные системы существуют и у грамположительных бактерий, однако в этом случае в них не входят периплазматические связывающие белки. [c.173]

Рис. 4.14. Использование кислородного электрода для изучения процессов превращения энергии в митохондриях. На схеме показаны шесть различных способов воздействия на пути превращения энергии в митохондриях. Схематические кривые показаний кислородного электрода иллюстрируют, как с его помощью можно изучать эти воздействия. Среда инкубации должна иметь соответствующую осмолярность, буферную емкость и содержать Рь а — ингибирование транспорта субстрата й — ингибирование дегидрогеназы субстрата с — ингибирование дыхательной цепи — ингибирование транслоказы адениновых нуклеотидов е — ингибирование АТР-синтетазы f — добавка протонофора.

Опыты на субклеточных пузырьках показали, что освещение вызывает быстрое выделение Н+ затем следует очень медленное поглощение выделенных ионов. Поглощение резко ускоряется протонофорами, как если бы ионы Н+ черпались из водной фазы внутри пузырька. С другой стороны, протеолипосомы, имеющие обратную ориентацию мембраны, в ответ на свет демонстрируют быстрое поглощение Н+, после чего происходит медленное выделение этих ионов. [c.110]

По всей вероятности, работа мотора происходит без каких-либо конформационных изменений образующих его белков или других событий, сопутствующих ферментативному катализу, который всегда сильно тормозится при таком значительном снижении температуры. Кроме того, можно заключить, что ротор прямо не контактирует с липидной фазой. Известно, что температурный сдвиг такого масштаба, как в опытах Г. Берга, тормозит даже столь простой процесс, как проведение протонов через липидную мембрану низкомолекулярными разобщителями-протонофорами. Другой факт, отличающий мотор от ферментов-переносчиков ионов Н+, — отсутствие изотопного эффекта при замене Н2О на D2O. [c.173]

Поскольку лактат — это естественный консервант, снижающий иногда pH до 3, он препятствует развитию микробиоты разложения и гниения (например, клостридий). Ту же самую цель преследует и искусственное снижение pH (маринование — добавление уксуса, лимонной или бензойной кислоты). При низком pH короткоцепочечные алифатические жирные кислоты становятся протонофорами, препятствуя таким образом развитию микроорганизмов. Свойство образовывать лактат при брожении используется при квашении капусты, засолке огурцов, приготовлении молочнокислых продуктов, силосовании кормов, в заквасках для ржаных сортов хлеба и добавках в сырокопченые колбасы, а также для получения чистой молочной кислоты. [c.124]

Рассмотренные варианты работы переносчиков показаны на рис. ХХ.З, здесь же изображен механизм переноса Н липофильными проводниками протонов. Перенос протонов через мембрану осуществляется в основном слабыми кислотами, диссоциированная форма которых присоединяет Н+ с образованием нейтральной молекулы. Недиссоциированная форма протонофора пересекает мембрану, двигаясь по градиенту концентрации перенос отрицательно заряженной анионной формы в обратном направлении происходит под действием электрического поля. По такому механизму работают разобщители окислительного и фотосинтетического фосфорилирования, повышающие проницаемость БЛМ и энергосопрягающих мембран для Н+, такие, как 2,4-динитрофенол, карбонилцианидхлорфенилгидразон, тетра-хлортрифторметилбензимидазол и др. (рис. XX.4). [c.106]

ДЦКД и ДЭС может быть обусловлено не только подавлением активности Н+-АТФазы плазмалеммы, но и в определенной степени угнетением клеточного метаболизма в целом [3481. В свою очередь, протонофоры способны снижать электрогенную компоненту как [c.37]

Предварительную информацию о том, что возникновение Ер клетки высшего растения тесно связано с активным транспортом Н+ через плазмалемму. может предоставить в опытах in vivo сравнение эффектов влияния на Е протонофоров (чаще всего КЦХФГ) и таких [c.37]

Определенную проблему при этом составляет выбор рабочих концентраций ингибиторов Н -АТФазы. Дело в том, что использование низких концентраций ингибиторов, позволяющих достаточно однозначно судить об их влиянии на Ер путем угнетения активности №-АТФазы [3481, в опытах in vivo далеко не всегда оказывается эффективным. Снижение Ер в зтих условиях обычно составляет менее ЗОХ от исходного уровня, что дает возможность лишь тестировать участие Н+-АТФазы в работе протонного насоса (1861. Особенно неэффективен в опытах in vivo, судя по некоторым данным [186, 354, 6721, ванадат, являющийся, по-видимому, наиболее специфическим ингибитором Н -АТФазы плазмалеммы из числа известных на сегодняшний день [356, 5071. Это обстоятельство нередко заставляет исследователей идти на увеличение рабочих концентраций ингибиторов в ущерб избирательности их действия на Н -АТФазу плазмалеммы. При использовании высоких концентраций ингибиторов Н -АТФазы угнетение Ер достигает 50Х и более. Поскольку такое значительное угнетение Ер оказывается сопоставимым по величине с угнетением Ер в присутствии, например, протонофора КЦХФГ [2151. можно заключить, что Н -АТФаза плазмалеммы. выступая в качестве электрогенного протонного насоса, вносит по меньшей мере определяющий вклад в формирование / интактных клеток высших растений. [c.38]

Рис. 5.9. Типичный эксперимент по измерению скорости дыхания с помощью кислородного электрода, который позволяет определить относительное расположение мест действия ингибиторов и точек подачи электронов в дыхательной цепи. Митохондрии печени инкубировали в среде, насыщенной воздухом и содержащей F P [протонофор, позволяющий создать условия, при которых протонная проводимость митохондрий не является фактором, лимитирующим скорость (разд. 2.5.3)]. Исходно в среде присутствует ЫАО+-зависимый субстрат—р-гидроксибутират. Ротенон (1 мкМ) полностью ингибирует дыхание, но не препятствует окислению сукцината. Антимицин А блокирует окисление сукцината, но не аскорбата в присутствии TMPD. Цианид является ингибитором и в последнем случае. Дитионит (S2O4 ) добавлен, чтобы неферментативным путем вызвать аноксию.

Если A lн =0, то при переносе электронов не про-1СХОДИТ синтез АТФ. Поэтому вещества, индуцирующие тротонную проницаемость мембран (протонофоры), ра-юбщают процессы окисления и фосфорилирования. [c.29]

Состояние Зразобщ высокая скорость дыхания достигается благодаря добавлению протонофора [c.73]

Рис. 4.7. Сафранин как индикатор Дф в митохондриях (Акеппап, У1кз1гот, 1976). Митохондрии из клеток печени инкубировали в присутствии ротено-иа, блокирующего дыхание (разд. 5.6). А. Кривая показывает образование диффузионного потенциала величиной 124 мВ после добавления валиномицина. Концентрация К+ в среде составляла 0,96 мМ, а в матриксе принималась равной 120 мМ. Б. Образование Дф было вызвано добавлением субстрата дыхания— сукцината, а рассеивание — добавлением протонофора. В. Дтр был образован благодаря гидролизу АТР и снят после добавления ингибитора АТР-синтетазы — олигомицина (разд. 7.2). Среда инкубации содержала 10 мкМ сафранина. Измерения проводились на двухволновом спектрофотометре (разд. 5.2).

Рис. 4.11. Определение стехиометрии Н+/АТР в субмитохондриальных частицах (Thayer, Hinkle, 1973). Субмитохондриальные частицы из сердца быка инкубировали в среде с низкой буферной емкостью, содержащей КС1 и валиномицин. Субстратов дыхания не добавляли. Среда содержала 2 мМ Mg2+, так как АТР реагирует лишь в форме комплекса с Mg2+. Исходный pH составлял 6,1, так что скалярные протоны при гидролизе АТР не выделялись. После того как pH стабилизировался, добавляли 25 нмолей Mg — АТР. В присутствии олигомицина закисления не наблюдалось, а в присутствии протонофора (СССР) происходило небольшое закисление, которое затем быстро исчезало.

Rb, <С-метиламии и Н-ацетат для измерения А)хн+ (разд. 4.2). Среда также содержала ADP и протонофор F P в различных субоптимальных концентрациях (разд. 2.5). Для каждой концентрации F P после установления [c.86]

Протонофоры разобщают окислительное фосфорилирование, повышая протонную проводимость через бислойные участки мембраны (разд. 2.5). Они могут быть использованы для снятия ингибирования входа протонов, возникающего при блокировании синтеза АТР. В результате такие протонофоры, как, например, F P, могут индуцировать быстрое дыхание (состояние Зразобщ) независимо от присутствия олигомицина, атрактила-та или отсутствия ADP (рис. [c.91]

Рис. 4.19. Эксперимент с кислотной ванной , который доказал, что АТР может синтезироваться за счет АрН (Jagendorf, Uribe, 1966). Хлоропласты с разрушенной оболочкой (разд. 1.3) инкубировали в темноте при pH 4 в среде, содержаш,ей сукцинат. Были добавлены ингибиторы, блокируюш,ие перенос электронов. Сукцинат медленно проникал внутрь тилакоидов и освобождал там протоны, так что pH внутри тилакоидов опускался примерно до 4 (слева). Затем внешний pH быстро поднимали до 8, создавая на мембране ЛрН около четырех единиц, и одновременно добавляли ADP, Pi и Mg2+ (справа). Выход протонов через АТР-синтетазу приводил к синтезу до 100 молей АТР на моль синтетазы. Искусственные протонофоры, такие, как F P, ингибировали образование АТР.

Рис. 5.16. Перенос протонов цитохромоксидазой (Wikstrom, Krab, 1978). Митохондрии печени крысы добавляли в среду с низкой буферной емкостью, содержащую КС1 (для поддержания осмотического равновесия), валиномицин (для компенсации переноса зарядов при начальном выбросе Н+), ротенон и антимицин А (чтобы предотвратить перенос электронов на других участках дыхательной цепи). Для восстановления цитохрома с добавляли ферроцианид после отброса пера самописца, обусловленного этой добавкой, наблюдалось закисление среды (/), которое затем сменялось постоянным защелачиванием (II), так как протоны проникали обратно в матрикс. В присутствии протонофора III) наблюдалось лишь поглощение Н+. А. Запись с помощью Ог-электрода. . Запись с помощью рН-электрода. В. Начальные условия. Г. Стационарные условия.

Если от субмитохондриальных частиц отделить Fi, что сделать нетрудно, то такие частицы не только не синтезируют и не гидролизуют АТР, но не способны также катализировать любые энергозависимые процессы. При добавлении олигомицина или связывании Fi способность к этим реакциям восстанавливается. Эффект отделения FiOT мембраны оказывается аналогичным действию протонофора. Это указывает на то, что Fo в АТР-син-тетазном комплексе создает протонную проводимость между внешней средой и активным центром Fi. В норме перенос протонов сопряжен с синтезом АТР, однако после отделения Fi возникает неконтролируемая протонная проводимость, которая не зависит от синтеза АТР, но по-прежнему блокируется олигомицином или ДЦКД (рис. 7.3.). [c.152]

За прогиедший период хемиосмотическая гипотеза Митчелла получила целый ряд экспериментальных подтверждений. Одним из доказательств роли протонного градиента в образовании АТР при окислительном фосфорилировании может служить разобщающее действие на этот процесс некоторых веществ. Известно, что 2,4-динитрофенол (2,4-ДНФ) подавляет синтез АТР, но стимулирует транспорт электронов (поглощение О2), т. е. разобщает дыхание (окисление) и фосфорилирование. Митчелл предположил, что такое действие 2,4-ДНФ связано с тем, что он переносит протоны через мембрану (т. е. является протонофором) и поэтому разряжает ее. Это предположение полностью подтвердилось. Оказалось, что разные по своей химической природе вещества, разобщающие окисление и фосфорилирование, сходны в том, что, во-первых, они растворимы в липидной фазе мембраны, а, во-вторых, это слабые кислоты, т. е. легко приобретают и теряют протон в зависимости от pH среды. В. П. Скулачев на искусственных фосфолипидных мембранах показал, что чем легче вещество переносит протоны через мембрану, тем сильнее разобщает эти процессы. Другое экспериментальное подтверждение роли протонного градиента в фосфорилировании было получено Митчеллом, который сообщил о синтезе АТР в митохондриях в результате замены щелочной инкубационной среды на кислую (т. е. в условиях искусственно созданного трансмембранного градиента ионов Н ). [c.159]

Более существенно, что схема редокс-петли оказывается неспособной объяснить важное наблюдение, сделанное М. Викстрё-мом (1977) добавление доноров электронов (ферроцианида либо цитохрома с) к митохондриям или цитохромоксидазным про-теолипосомам вызывает временное закисление инкубационной среды, которое обусловлено работой цитохромоксидазы и снимается разобщителями — протонофорами. Как удалось установить в опытах с протеолипосомами, ионы Н+, выделенные в среду, черпаются из внутреннего пространства этих пузырьков заметное закисление наблюдали лишь в том случае, если пузырьки содержали рН-буфер. Отношение Н+/е оказалось равным единице. [c.93]

По некоторым данным, A j,H необходим не только для экспорта определенных белков из цитоплазмы, но и для удержания цитоплазматических белков внутри бактериальной клетки. Показано, что в оболочке устойчивого к протонофорам мутанта Е. соИ. который выращен в присутствии протонофора, обнаруживается какой-то новый белок массой 42 кДа. Белок, найденный как в цитоплазматической, так и во внешней мембране клетки, оказался рибосо-мальным фактором элонгации Tu EF-Tu). [c.167]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология