Элюирование конкурентное

Равновесная модель для элюирования конкурентным ингибитором [c.30]

ЭЛЮИРОВАНИЕ КОНКУРЕНТНЫМИ АФФИННЫМИ ЛИГАНДАМИ [c.92]

В литературе можно найти много примеров элюирования конкурентными лигандами. В гл. 10 (рис. 10.5) описано выделение [c.92]

Биоспецифическое элюирование конкурентными ингибиторами применяется при выделении химотрипсина и трипсина нз панкреатических экстрактов с помощью аффинной хроматографии на ага- [c.267]

Адсорбционная ТСХ основана на конкурентном взаимодействии полярных групп вещества и молекул растворителя с активными центрами неподвижной твердой фазы (адсорбента). Неполярная подвижная фаза смешивается с определенным количеством более полярного растворителя (углеводород- -спирт), при этом при увеличении концентрации полярного компонента увеличивается (/ /), Подвижность разделяемых веществ растет, так как они вытесняются с активных центров адсорбента в результате конкуренции с элюентом. Определенный вклад вносит также взаимодействие разделяемых веществ с элюентом. Для элюирования неполярных веществ используют неполярные подвижные фазы, в которых они элюируются раньше, чем полярные вещества. Так как сорбенты содержат различные функциональные группы с различным распределением их по поверхности, разделяемые компоненты обычно представляют собой сложные [c.342]

Значительно большие возможности для повышена К. в системе ионит - раствор дает использование реакций комплексообразования в жидкой фазе. В этом случае элюирование из ионита достигается не за счет конкурентной сорбции другого иона, а в результате смещения равновесия в растворе в сторону образования (нейтральных или одноименно заряженных с функциональными группами ионита) комплексных соединений. При использовании растворов комплексообразователей в качестве элюентов значения близки к отношению констант устойчивости комплексов разделяемых элементов. Поэтому при отсутствии справочных данных по коэффициентам распределения в растворах того или иного комплексообразователя для ориентировочной оценки значений можно воспользоваться данными по константам устойчивости комплексов разделяемых ионов металлов с лигандами, присутствующими в элюенте. [c.202]

Как указывалось в гл. 2 (рис. 2.1), специфически сорбированный выделяемый фермент может быть освобожден из комплекса с пришитым аффинным лигандом либо при помощи раствора конкурентного ингибитора (биоспецифическое элюирование), либо при изменении среды. Последний метод является более общим как правило, меняют pH или ионную силу раствора. Хотя влияния таких изменений могут иметь сложный характер, Грейвс и Ву [3], выводя закономерности для освобождения фермента с аффинного [c.26]

Другим наиболее часто применяемым методом освобождения фермента из его комплекса со связанным лигандом является элюирование фермента раствором конкурентного ингибитора. При этом основное требование состоит в сохранении значения Кь в ходе процесса элюирования. Уравнения (3.1) и (3.2), описывающие равновесие между ферментом и связанным аффинным лигандом, необходимо дополнить [c.30]

Теоретические основы элюирования ферментов конкурентными ингибиторами уже рассмотрены в гл. 3 (рис. 3.6). [c.92]

Конкурентное элюирование лигандом [c.113]

Большинство замечаний относительно элюирования свободным лигандом касаются также ингибиторов и аллостерических модификаторов. Для проведения конкурентного элюирования свободным лигандом важным параметром во всех случаях является концентрация иммобилизованного лиганда. Если концентрация последнего чрезмерно велика, то в случае систем с высоким сродством возникают трудности при применении этого метода элюирования (разд. 3). [c.113]

В отсутствие конкурирующего лиганда [Ь]=0, тогда Кь пропорциональна 1/(У—Уо). Таким образом, для матрицы с постоянным значением [Ь], использованной для конкурентного зонального элюирования, Кь можно достаточно надежно найти по одной кривой элюирования. [c.223]

Поведение БНФ-П при зональном элюировании с Ме1-Туг-РЬе-аминоалкил-агароз соответствует схеме кооперативного связывания, отличающейся от строго моновалентных или бивалентных моделей. Объемы элюирования обычно уменьшаются с увеличением концентрации конкурентного пептида (например, окситоцина или вазопрессина) в элюирующем буфере, как показано, например, на рис. 3. Однако, когда полученные при кон- [c.237]

Рис. 2.1. Схема биоспецифической адсорбции (Л), элюирования деформирующим буферным раствором (5) и биоэлюнрования растворимым конкурентным лигандом (В) [17].

Для упорядоченного механизма иммобилизация лиганда А подвержена обычным ограничениям аффинной хроматографии. Б этом случае иммобилизация лиганда В не приводит к конкурентному сорбенту для комплементарной молекулы исключение составляют случаи, когда лиганд А присутствует в рабочем буферном растворе, в котором наносят фермент на колонку. Таким образом, присутствие лиганда А является необходимым для связывания сорбентом ферментов, поскольку лиганд В связывает двойной комплекс лиганд А — фермент. Это позволяет ввести в хроматографию предварительный отбор — из бирательное связывание, последующее элюирование достигается удалением лиганда А из рабочего буферного раствора. [c.110]

Изящный вариант каскадной методики такого типа был продемонстрирован недавно на примере выделения цитрат-син-тетазы (К. Ф. 4.1.3.7) и фумаразы (К. Ф. 4.2.1.2) с использованием одной и той же аффинной колонки, содержащей пиромел--литовую кислоту (ПМК), присоединенную к сефарозе 4В через пространственную группу диаминопропанола. Экстракт ткани наносят на колонку с ПМК-сефарозой 4В в 0,01 М фосфатном буфере (pH 7,3), содержащем 0,01 М меркаптоэтанол. Цитрат-синтетаза сорбируется полностью, в то время как связывание фумаразы в присутствии фосфата подавляется (фосфат — конкурентный ингибитор этого фермента). Цитрат-синтетазу элюируют тем же буфером, содержащим 0,01 М лимонную кислоту. Полученный элюат наносят на колонку с гелем голубой сефарозы 4В, где фермент связывается количественно, и далее элюируют 0,01 М фосфатным буфером (pH 7,3), содержащим меркаптоэтанол (но не содержащим лимонной кислоты). Фракцию фумаразы, не сорбированную на ПМК-сефарозе 4В в условиях элюирования фосфатом и содержащую 100% ферментативной активности, подвергают диализу против 0,01 М трис-ацетатного буфера (pH 7,3), содержащего 0,014 М меркаптоэтанол и наносят на колонку с ПМК Сефарозой 4В в указанном буфере. При этом наблюдается количественное связывание фермента, элюирование которого проводят в присутствии ь-яблочной кислоты и далее, после удаления последней, фумаразу сорбируют на колонке с голубой сефарозой, а затем проводят элюирование, вновь добавляя яблочную кислоту в рабочий трис-ацетатный буфер. [c.190]

Рис. 2. Схематическая диаграмма аффинной хроматографии с конкурентным зональным элюированием, изображающая взаимодействия подвижных и иммобилизованных компонентов, В приведенном примере элюирующий буфер содержит растворимый лиганд, конкурирующий с иммобилизованным лигандом за связывание с тем же активным положением подвижного компонента (в данном случае белка) [3].

Рис. 3. Примеры кривых конкурентного зонального элюирования в ряде экспериментов с системой нейрофизин — пептид, показывающих хроматографическое поведение зон белка, элюированных с иммобилизованного лиганда увеличивающимися количествами конкурентного лиганда в элюирующем буфере. Зоны (каждая по 100 мкл на 2 мл адсорбента) [ 251]-меченного бычьего нейрофизина II элюировали с Ме1-Туг-РЬе-аминобутил-агарозы 0,4 М ацетатом аммония (pH 5,7), содержащим конкурентный лиганд лизинвазо-прессин при различных концентрациях. Увеличение концентрации растворенного конкурирующего лиганда приводит к пропорциональному уменьшению объемов элюирования меченого белка [4].

Это выражение позволяет оценивать константы диссоциации Кь и Ки для бивалентных веществ Рг путем измерения V при различных значениях [Ь]. Однако в отличие от систем моновалентного связывания для бивалентных систем зависимость 1/ У—Уо) от [Ь] нелинейна. Таким образом, Кь и /Сь находят по данным конкурентного элюирования путем обработки нелинейной зависимости методом наименьших квадратов. Несмотря на это различие, методика для получения данных в случае систем бивалентного связывания полностью аналогична таковой для моновалентной системы. [c.224]

Рис. 4. Аффинная хроматография с конкурентным зональным элюированием для системы с моновалентным связыванием. Зоны, содержащие равные количества нуклеаз стафилококков, наносили на колонку с рс1ТрАР-сефа-

На рис. 4 представлены результаты, полученные при элюировании зон нуклеазы стафилококков с pdTpAp-сефарозы при различных концентрациях растворимого конкурентного лиганда [3]. Линейность зависимости 1/(У—Уо) от [L] отражает 1 1-природу взаимодействия фермент — нуклеотид эта зависимость может быть использована для расчета констант диссоциации / l и /Сс с использованием моновалентных моделей [уравнение (2)]. Рассчитанные константы приведены в табл. 1 там же приведены результаты для двух других конкурентных лигандов. [c.234]

При конкурентном элюировании бивалентных мономеров ТЕРС 15 IgA, полученных восстановлением и селективным алки-лированием ТЕРС 15 IgA, с иммобилизованного фосфорилхолина при концентрации лиганда 5-10 моль/л (функциональная [c.235]

Рис. 5. Аффинная хроматография с конкурентным зональным элюированием для системы с бивалентным связыванием. Зоны (100 мкл) мономера [ ]IgA (бивалентное связывание) наносми на фосфорилхолин-сефарозу с высокой плотностью лиганда (7X25 мм, [Ь]=5-10-5 моль/л), уравновешенную МаСЬ натрийфосфатным буфером (содержащим 1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина) фосфорилхолин имел следующие концентрации (моль/л) 7 — 0 2—1 10- 5 —2,5-10-6 4 — 5,010- 5 — 7,5-10- 5—1,0-10-5. Элюирование осуществляли при комнатной температуре буфером, содержащим указанное количество растворенного конкурентного фосфорилхолина. В правом верхнем углу по данным элюирования построена зависимость 1/(К—Уо) от концентрации фосфорилхолина. Константы диссоциации /Сь и /Сп рассчитаны с помощью этого графика с использованием уравнения (5) и приведены в табл. I [9].

Рис. 6. Конкурентное зональное элюирование бивалентных мономеров IgA с фосфорилхолин-сефарозы с низким содержанием лиганда. Зоны мономера [ ]IgA нан или на фосфорилхолин-сефарозу с низкой плотностью лиганда (7x25 мм, [L]=9-10 моль/л) условия элюирования аналогичны приведенным на рис. 5 для колонки с фосфорилхолин-сефарозой с высокой плотностью использованы следующие концентрации растворенного фосфорилхолина (моль/л) /-0 2—ЫО- 5-5-10" -i-ЫО-в 5 —2,5-10- .

Справочник химика 21

Химия и химическая технология