Гель-фильтрация биогели

Рис. 73. Двухступенчатая очистка одного из негистоновых щелочных белков хроматина тимуса ( белок АК ) методом гель-фильтрации на биогеле Р-60

При определении молекулярной массы с помощью гель-фильтрации [70, 73] применяют сефадексы различного типа (0-50, 0-100, 0-150, 0-200), агарозы (сефарозы 2В, 4В, 6В) или полиакриламиды (биогели Р-100, Р-150, Р-300). Процесс проводят как в хроматографических колонках, так и на тонкослойных пластинках. Принцип метода уже рассматривался в разд. 3.3. [c.361]

Молекулярно-ситовая хроматография. При данном виде хроматографии используется способность материалов с контролируемой пористостью сортировать и разделять компоненты смеси в соответствии с размерами и формой их молекул. Для осуществления процесса гель-хроматографии используются гели поперечно-емкостного декстрана (сефадексы и сефакрилы), поперечно-сшитые полиакриламидные гранулы (биогели), агарозные гели с выраженными в них цепями акриламидного полимера (ультрагели) и более жесткие поперечно-сшитые агарозы (СЬ-агарозы и сефакрилы-8), с помощью которых можно быстро разделить макромолекулы в соответствии с их размером. Степень удерживания растворенного вещества на колонке зависит от его способности проникать в поры геля. Поэтому при гель-фильтрации сначала выходят высокомолекулярные вещества, а затем вешества в порядке убывания их моле- [c.55]

Предварительное фракционирование с помощью полиакриламидного геля дает такие же результаты, как и гель-фильтрация на сефадексе. В отличие от природного декстранового геля, каким является сефадекс, полиакриламидный гель представляет собой гель синтетического полимера, обладающий чрезвычайно малыми абсорбционными свойствами. Поэтому разделение на полиакриламидном геле можно провести практически без потерь фракционируемого материала. Молекулярный вес фракционируемых веществ также очень существен для разделения на полиакриламидном геле. Чем ниже молекулярный вес компонентов разделяемой смеси, тем меньше индекс биогеля, который целесообразно использовать для фракционирования. [c.228]

Для тонкослойной гель-фильтрации слой носителя готовят из самых мелких гранул геля. Из препаратов, имеющихся в продаже, применяются гели декстрана марки сефадекс сверхтонкий или полиакриламидные биогели марки —400 меш . В описанных в литературе методиках тонкослойной гель-хроматографии в основном [c.238]

Для фракционирования нуклеозидов можно использовать продажные гель-фильтрующие материалы Сефадекс G10 и G15 и Биогель Р2. Преимущества этих материалов в том, что элюируемые вещества не размываются по колонке, количественно снимаются с колонки и нет необходимости применять солевые градиенты. Также маловероятно, что в условиях гель-фильтрации будут протекать какие-либо химические процессы деградации лабильных нуклеозидов, т. е. что-либо похожее на процессы, обязательно происходящие при ионообменной и адсорбционной хроматографии. 127]. [c.74]

Биогели серии А. Американская фирма Bio-Rad выпускает агарозные матрицы для гель-фильтрации под торговым наименованием Bio-Gel А . Нет нужды останавливаться на свойствах этих матриц — они аналогичны тем, что были описаны для сефарозы. Ниже представлены параметры шести тппов этих матриц. [c.120]

Использование гель-фильтрации для освобождения от радиоактивных предшественников неоднократно цитировалось при описании методов введения радиоактивной метки в белки и нуклеиновые кислоты [Остерман, 1983]. Нередко обессоливание используют и на заключительном этапе очистки для освобождения не только от соли, но и от прочих низкомолекулярных примесей. Например, в одной из работ по выделению РНК-полимеразы очисткой белка на биогеле А-1,5т завершалась целая серия операций, включавшая различные варианты переосаждений белка и ионообмениой хроматографии [Vaisius, Horgen, 1979]. [c.138]

Гель-фильтрация является наиболее мягким способом фракционирования целлюлаз. Метод наиболее эффективен для отделения целлобиаз, имеющих значительно более высокую молекулярную массу, чем эндоглюканазы и целлобиогидролазы, или низкомолекулярных эндоглюканаз с молекулярной массой менее 20000 Ла. Среди носителей наиболее эффективны сефакрил S-200, ультрагели (Pharma ia), биогели (Bio-Rad). Применение гель-фильтрации эффективно и для групповой очистки эндоглюканаз и целлобиогидролаз, однако низкая разрешающая способность полидисперсных носителей, как правило,не позволяет разделить множественные формы этих ферментов с близкими Mr (см. табл. 5.1). Недостатком метода является многократное увеличение объема наносимых образцов в ходе элюции, что требует последующего концентрирования, длительность процесса. [c.126]

При групповом разделении смеси высокомолекулярные соединения не фракционируются. Гель-фильтрация в данном случае, подобно диализу, используется для отделения белков от низкомолекулярных примесей и может заменить его. Обессоливание белков можно проводить на сефадексах G-25 и G-50, а также на биогелях Р6 и РЮ. Для обессоливания пептидов следует применять сефадексы G-10 и G-15 или биогели Р2 и Р4. [c.221]

Материал для гель-фильтрации должен иметь интервал фракционирования, соответствующий данной цели. Для полного исключения исследуемого вещества используют гель с интервалом фракционирования, верхний предел которого значительно ниже, чем молекулярная масса этого вещества, например, для исключения большинства белков применяют сефадекс u-25 (интервал фракционирования для молекулярных масс от 100 до 5000), а для веществ с молекулярной массой выше 3000 — сефадекс G-10 (интервал фракционирования для молекулярных масс от О до 1500). Для полного уравновешивания анализируемого соединения с жидкостью во внутреннем объеме геля (К,) и последующего элюирования его с солевым объемом (Ko+ i) выбирают гель с интервалом фракционирования, нижний предел которого превышает молекулярную массу данного соединения. При фракционировании вещества (или веществ) гель должен иметь такой интервал фракционирования, при котором это вещество (или вещества) элюировалось бы с некоторой задержкой, например, для фракционирования сывороточных белков используют сефадекс G-200 (предел исключения 200 000), а для определения их молекулярных масс — биогель А, 0,5 М (предел исключения 500 ООО), [c.226]

Наконец, отметим возможность быстрой и эффективной очистки гель-фильтрацией целых вирусов и фагов. Например, в недавней работе из 1 л суспензии Е. соИ, зараженных фагом X, после обработки бактериального лизата ДНКазой, РНКазой и концентрирования фагов переосаждением полиэтиленг иколем ПЭГ-6000 за одну операцию гель-фильтрации на колонке биогеля А-5т объемом 125 мл удавалось полностью очистить до 65% инфекционного материала [Sain, Erdei, 1981]. [c.145]

Эти ионообменники получают на основе носителей для гель-фильтрации - поперечно-сшитых декстранов (сефадекс) или агароз (сефароза СЬ, биогель А). Они обладают свойствами ионообменников и гель-фильтрующих материалов и гораздо меньшей обменной емкостью к молекулам, превышающим по своим размерам предел эксклюзии ионообменника в условиях эксперимента. Из-за наличия заряженных групп степень набухания таких смол и, следовательно, предел эксклюзии варьируют в зависимости от pH и ионной силы (нехарактерным для гель-фильтрующих материалов образом). [c.437]

При гель-фильтрации наиболее употребительны два типа гелей гели, полученные путем ферментирования декстрана (сефадексы), и синтетические гели акриламида (биогели). Акриламидные гели обладают низкой адсорбционной способностью, поэтому при равной разрешающей способности для них характерен больший выход фракционируемого вещества, чем для гелей декстрана. [c.37]

При групповом разделении методом гель-фильтрации удается в значительной мере избежать разбавления, если учитывать объемные соотношения, подробно рассмотренные в разделе Обессоливание . При очистке суспензии вируса (выделенного из столовой свеклы) от сопутствующих пигментов путем гель-фильтрации на 4—6-кратном (по отнощению к объему образца) объеме сефадекса 0-75 разделение составляло лишь 20—30% [14]. Свободные от белков катехоламины — адреналин и норадреналин — были выделены без разбавления из 20 мл сыворотки (27% объема колонки) гель-фильтрацией на сефадексе 0-25 (2X25 сж, 78 мл) [15]. Кислюк [16] показал, что с помощью гель-фильтрации на сефадексе 0-50 удается гораздо легче отделить фермент от его кофакторов, чем с помощью диализа. Таким путем удается получить кофакторы в сравнительно небольшом объеме и изучить эффект их вторичного присоединения к ферменту. После гель-фильтрации был выделен совершенно неактивный белок, активность которого вновь восстанавливалась (до 86% исходной) после добавления низкомолекулярной фракции. При диализе активность фермента снижалась только до 38% [16]. Групповое разделение гель-фильтрацией оказалось чрезвычайно удобным методом отделения низкомолекулярных антигенов от антител. Диссоциацию комплекса антиген — антитело часто осуществляют, добавляя избыток гаптена, который затем можно легко отделить от белка гель-фильтрацией [17]. В бактериологии гель-фильтрация на сефадексе 0-75 или биогеле Р-100 может служить для удобного выделения экстрацеллюлярных токсинов. Перед засевом культуральную среду освобождают от высокомолекулярных примесей гель-фильтрацией. Затем на той же колонке после удаления бактерий можно вновь отделить высокомолекулярные токсины от культуральной среды [18]. [c.142]

В связи с изучением механизма биосинтеза пуромицина было исследовано ферментативное метилирование 0-деметилпуро-мицина [86]. Это соединение было синтезировано и очищено на колонке с силикагелем. Полученный из предшественника пуро-мицин выделяли ТСХ на целлюлозе и идентифицировали ТСХ и электрофорезом на бумаге. Для очистки пуромицина использовали также гель-фильтрацию на биогеле Р-2 в 0,01 М растворе карбоната аммония, содержащем 0,05% додецилсульфата натрия [87]. [c.226]

Ди- и тринуклеотидь легко обессоливаются путем гель-фильтрации на биогеле Р-2 (50—100 или 100—200 меш). [c.92]

Для растворения и разделения крупных пептидов могут быть использованы 8 М мочевина с последующей ио1юобмен юй хроматографией в этом же растворе [25] или 100%-ная муравьиная кислота с гель-фильтрацией на биогелях в 20—70%-ной муравьиной кислоте [1]. Солюбилизация достигается также модификацией остатков лизина в пептидах цитраконовым ангидридом фракционирование проводится на колонках с биогелем или сефадексом при нейтральных pH. [c.348]

Метод гель-фильтрации широко используют на первой стадии разделения, поскольку при этом обычно достигаются высокие выходы, а крупные пептиды часто получаются в состоянии, не требующем дальнейшей очистки. Растворимые пептиды наносят на колонки с сефадексом 0-50 или 0-25 в аммонийбикарбонатном буфере и элюируют этим же буфером, контролируя процесс фракционирования спектрофотометрнчески при 280 нм (максимум поглощения остатков триптофана и тирозина) и 230 нм (максимум поглощения пептидной связи). Для полного растворения исходной смеси в небольшом объеме (для нанесения на колонку) иногда следует добавить небольшое количество кристаллической мочевины. Пептиды, полученные при гидролизе пепсином, плохо растворяются при нейтральном pH, их солюбилизируют в небольшом объеме 100%-ной муравьиной кислоты, разбавляют до 5%-ной концентрации и наносят на колонки с сефадексом или биогелем, уравновешенные тем же раствором. [c.353]

За последние десять лет разработан принципиально новый хроматографический метод фракционирования макромолекул, вирусов и компонентов клетки, который широко используется в аналитической и препаративной биохимии, Этот метод основан на способности пористых материалов, работающих по принципу обратных молекулярных СИТ)), разделять смесь веществ по размеру и молекулярному весу компонентов. Эти молекулярные сита почти не обладают сорбционным сродством к фракционируемым веществам. В качестве таких пористых материалов применяют гранулированные гели полисахаридов (сефадексы, агароза), полиакриламида (биогели) и пористое порошковое стекло. Метод подобного фракционирования обычно называют молекулярно-ситевой хроматографией, молекулярной фильтрацией или гельфильтрацией. [c.125]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология