Электрофорез блоки электрофоретические

Электрофорез используется для выделения и разделения ферментов на конечных стадиях очистки, а также для препаративных и аналитических целей. Для препаративного выделения и очистки ферментов проводят зонный электрофорез па бумаге и в блоках или на колонках с различными наполнителями (целлюлозным порошком, крахмалом и другими), а также электрофорез в гелях — агар-агаровом, крахмальном, полиакриламидном. Электрофорез в гелях отличается от электрофореза на порошкообразных или пористых носителях. Здесь сочетаются два метода разделения ферментов — электрофоретический и метод, основанный на гель-фильтрации. Фракционирование ферментов на основе различной электрофоретической подвижности оказывается одним из самых эффективных методов. [c.201]

Еще большее число белковых фракций (свыше 30) можно получить методом иммуноэлектрофореза (рис. 17.1). Этот метод представляет собой своеобразную комбинацию электрофоретического и иммунологического методов анализа белков. Иными словами, термин иммуноэлектрофорез подразумевает проведение электрофореза и реакции преципитации в одной среде, т.е. непосредственно на гелевом блоке. При данном методе с помощью серологической реакции преципитации достигается значительное повышение аналитической чувстительности электрофоретического метода. [c.569]

При применении этого метода наносят очень небольшие количества концентрированного раствора исследуемого препарата на старт в виде узкой полосы. В результате электрофореза (может быть приложена весьма высокая разность потенциалов, поскольку в геле подавляются конвекционные токи) смесь будет разделяться на ряд зон, что позволяет получить более высокое разрешение, чем при работе по методу свободной границы. Более того, можно варьировать средний размер пор и распределение пор по размерам для некоторых поддерживаюш,их сред (крахмал, агар, полиакриламид) таким образом, что действие одного из факторов, влияюш их на электрофоретическую подвижность, а именно гидродинамического сопротивления, будет столь велико, что часть молекул будет практически неподвижной [30]. Электрофоретические подвижности в гелях или на бумаге нельзя непосредственно сравнивать с электрофоретическими подвижностями, измеренными методом свободной границы, кроме тех случаев, когда рассматриваемые молекулы малы по сравнению с размерами пор в поддерживающей среде. Компактные белки с молекулярным весом вплоть до 50 ООО легко диффундируют в 5%-ном полиакриламидном геле, и даже с веществами большего молекулярного веса можно получить хорошие результаты. Бумагу или гелевый блок нужно окрасить, чтобы показать положение различных компонентов можно также сделать перенос на подходящим образом вырезанный кусок фильтровальной бумаги, хотя эта методика часто малочувствительна. Обычные красители, применяемые для обнаружения белков (нигрозин, амидовый черный), дают удовлетворительные результаты для многих гликонротеинов, но некоторые эпителиальные вещества, которые могут представлять собой по существу углеводы (до 90%), окрашиваются довольно плохо. Было найдено, что для кислых гликонротеинов лучше применять толуидиновый голубой [32] или муцикармин [33], а алциановый голубой окрашивает как кислые, так и нейтральные гликопротеины [34]. Наиболее общей методикой окрашивания является, по опыту автора, методика Райдона и Смита [35] (хлорирование и обработка смесью крахмала и иодистого калия), но она неприменима на полиакриламидных гелях. [c.47]

С помощью электрофореза на крахмальном геле было показано, что 15 из известных 16 генетических вариантов трансферрина человека (см. ниже) разлагаются под действием нейраминидазы на четыре дополнительных медленно движущихся компонента, которые образуются ступенчато. Присутствие и относительная интенсивность окрашивания этих компонентов зависят от концентрации фермента (рис. 1 [25, 56]). Опыты по электрофорезу очищенного трансферрина в крахмальном блоке показывают (рис. 2), что происходит постепенное отщепление сиаловой кислоты от молекулы трансферрина. Каждый из четырех остатков сиаловой кислоты в молекуле трансферрина обусловливает определенное повышение электрофоретической подвижности цельной молекулы белка. По мере гидролиза кетозидных связей ферментом увеличивается количество отщепленной сиаловой кислоты. Этот процесс происходит до тех пор, пока все четыре остатка не будут удалены. После этого дальнейшее увеличение электрофоретической подвижности уже не обнаруживается. Полоса 4 (рис. 1) представляет собой необработанный трансферрин, в молекуле которого содержится полный комплект из четырех остатков сиаловой кислоты. Полосу О дают молекулы, из которых полностью удалены остатки сиаловой кислоты, полосы 1—3 — молекулы, содержащие соответственно от 1 до 3 остатков сиаловой кислоты. Обработка ферментом не влияет на способность трансферрина связывать железо, на его иммунологические свойства, а также на поведение при ультрацентрифугировании. Огупенчатое расщепление трансферрина, сходное с наблюдающимся при расщеплении нейраминидазой, обнаружил Поулик [57, 58] при обработке трансферрина дифтерийным токсином. Блюмберг и Уоррен [59] сообщили, что после обработки нейраминидазой одна полоса, соответствующая трансферрину, разделяется на две полосы равной интенсивности. Это явление наблюдается в том случае, если из молекулы трансферрина удаляется около 90% сиаловой кислоты. [c.123]

На рис. 2 представлена типичная картина электрофоретического разделения в агарозном блоке из сыворотки кролика 4184-изолировали три популяции антител к пневмококку типа III, обладающих различной электрофоретической подвижностью. Сыворотка содержала около 15 мг антител класса IgG в 1 мл. Получены четыре основные фракции, содержащие иммуноглобулины. Картина изоэлектрического фокусирования для трех из них (рис. 3) подтверждает эффективность электрофоретического метода можно видеть, что фракция 4 содержит в основном антитела с р1 7,7-—8 (медленно мигрирующий компонент), а фракция 2 (быстро мигрирующий компонент) — антитела с р 5,9—6,2. Фракция 3, как и следовало ожидать на основании электрофореграммы, содержит примесь фракции 2. Фракция 1 (на рис. 3 не Показана) по данным микрозонального электрофореза загрязнена другими сывороточными белками. С помощью количественной преципитации с полисахаридом пневмококка типа III было показано, что в элюат из геля выходит в общей сложности 74,2% антител, содержавшихся в нанесенном образце сыворотки. [c.66]

Оборудование, необходимое для электрофореза, состоит в основном из двух частей источника питания и собственно электрофоретического блока. Описываемое здесь оборудование применяется для работы с низким напряжением. Высоковольтный электрофорез — более специальный метод он рассмотрен в разд. 4.4.1. [c.119]

Самый простой способ обеспечения стабильности электрофоретических зон заключается в том, что в среду для электрофореза вводят вещества, образующие капиллярную структуру. Ан-тиконвекционные свойства такой системы весьма высоки, если площадь поперечного сечения капилляров достаточно мала, так как в канале круглого сечения скорость потока снижается пропорционально четвертой степени радиуса. В качестве поддерживающей среды чаще всего используются фильтровальная бумага, пленки из ацетата целлюлозы, колонки или блоки целлюлозного порошка, гранулированный крахмал или гранулы поливиниловых полимеров, а также агаровый, агарозный, крахмальный или полиакриламидный гели. Зональный электрофорез в поддерживающей среде имеет ряд важных преимуществ. При его проведении можно использовать какой-либо простой и сравнительно недорогой прибор и анализировать одновременно несколько различных препаратов. Процедуры визуализации зон и выделения фракций осуществляются довольно легко. Вещества, обладающие биологической активностью, можно выявить непосредственно на электрофореграммах. Метод легко приспособить как для крупномасштабного разделения веществ, так и для микроразделения. Удается достигнуть очень высокой разрешающей силы, особенно в среде, характеризующейся одновременно антикон векционными свойствами и эффектом молекулярного сита. [c.34]

НОЙ пластинке подходящего размера помещают в электрофоретическую камеру. Концы блока соединяют с электродными сосудами при помощи фитилей из фильтровальной бумаги. Для получения стартовой зоны на поверхности блока по линейке выдавливают булавкой ряд канавок. Необходимо следить за тем, чтобы случайно не проткнуть блок насквозь. Кончик булавки следует погружать не глубже чем на 2 мм при толщине блока 2,5 мм. Если разделяемые вещества бесцветны, то положение полученных фракций определяют при помощи реплики, которую делают, осторожно прижимая к поверхности блока пропитанную буфером и наполовину высушенную полоску тонкого целлогеля или ацетата целлюлозы. Затем полоску быстро окрашивают, пока электрофорез в блоке еще продолжается. Если положение фракций на ней можно выявить, электрофоретическое разделение прекращают и блок разрезают на сегменты в соответствии с обнаруженной картиной. Разделенные вещества можно получить, отжимая эти сегменты в пресс-шприце (фирма СЬете1гоп, Италия) или в обычном шприце. Согласно проспекту фирмы-изготовителя, в бло ке целлогеля толщиной 2,5 мм можно фракционировать 0,25—0,4 мл сыворотки крови или 0,1 мл 3%-ного гемолизата эритроцитов. [c.45]

Прибор для проведения электрофореза такого типа устроен весьма просто. Он состоит из двух электродных сосудов и лотка для поддержания блока (рис. 15). Лоток можно изготовить из стеклянной или плекоигласовой пластины соответствующего размера и двух плексигласовых брусков, расположенных вдоль боковых сторон пластины параллельно направлению электрофоретической миграции. Пластину и бруски покрывают листом тонкой полиэтиленовой пленки (рис. 16). К двум другим сторонам пластины плотно прижимают стопки толстой фильтровальной бумаги [898]. Можно также воспользоваться лотком с уже готовыми продольными стенками. В этом случае в дне лотка с обеих его сторон, расположенных перпендикулярно направлению электрофореза, прорезают две щели, в кото- [c.47]

Рис. 93. Электрофоретическая камера для полуавтоматического иикрометода перекрестного иммуноэлектрофореза, сконструированная Дэвисом и др. [279]. Основной блок, позволяющий проводить электрофорез в обоих направлениях на одной пластинке, состоит из четырех резервуаров (А—Г). Подсоединение дополнительных модулей (Д и Е) дает возможность проводить электрофорез на нескольких пластинках одновременно. Стрелки на электрофоретических пластинках (Я) указывают направление тока при электрофорезе в первом направлении. Стрелки яри цифрах I и 2 обозначают контакты соответственно первого и второго направлений.

Часто возникает задача определения молекулярных масс белков, которые удалось электрофоретически разделить по величине заряда. В этом случае проводят электрофорез в трубке в присутствии 8 М мочевины, а затем в перпендикулярном направлении в блоке в присутствии ДСН (двумерный электрофорез в геле обсуждается в разд. 7.3,2). [c.44]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология