Рибонуклеазы ренатурация

С. 11.13. Денатурация и ренатурация рибонуклеазы. Объяснение в кете. [c.373]

Рис. 8-8. Ренатурация развернутой (денатурированной) рибонуклеазы с воссозданием правильно расположенных дисульфидных поперечных связей. При добавлении мочевины в молекуле рибонуклеазы разрушаются водородные связи, а последующая обработка белка меркаптоэтанолом

С другой стороны, каучук, вулканизированный серой, сохраняет свойства статистического клубка, несмотря на наличие ди- и полисуль-фидных мостиков. Изучение обратимой денатурации белков с разрывом и последующим спонтанным восстановлением первоначальных дисульфидных связей, прежде всего исследование К. Анфинсена [7] денатурации и ренатурации рибонуклеазы А, склоняет к предположению, что не 8-8-мостики создают нативную структуру, а, напротив, структура, формирующаяся за счет слабых взаимодействий, приводит к сближению вполне определенные остатки цистеина и тем самым обусловливает избирательное образование системы дисульфидных связей. Таким образом, можно заключить, что белковую глобулу создают слабые невалентные взаимодействия. Невалентные взаимодействия в водорастворимом белке мог) т возникать между пептидными группами основной цепи, между боковыми цепями аминокислотных остатков, между звеньями основной цепи и боковыми цепями. Кроме того, поскольку белок сохраняет свою нативную конформацию и функционирует только в водном растворе при определенных, так называемых физиологических значениях pH и ионной силы, то структура определяется также взаимодействиями белка с молекулами воды и находящимися в ней соединениями и ионами. Окружающая среда, помимо этого, оказывает конкурирующее и иное влияние на внутримолекулярные взаимодействия. Рассмотрим сложившееся мнение о природе перечисленных взаимодействий, об их вкладах в конформационную энергию и, следовательно, влиянии на стабильность пространственной структуры белковой молекулы. [c.232]

Полученные Крейтоном результаты по ренатурации рибонуклеазы S [c.375]

Рис. 3-8. Денатурация и ренатурация на примере панкреатической рибонуклеазы (по Анфинсену).

Естественно, что полной обратимости денатурации следует ожидать для белков, не содержащих групп, вступающих в денатурированном состоянии в необратимые реакции (например, окисление 5 — Н-групп) [101]). Так, доказана обратимость денатурации рибонуклеазы [135], такаамилазы А [136] и а-амилазы [136]. В работах Анфинсена и др. [137—140] показано, что можно добиться ренатурации белков и с разорванными дисульфидными связями. Из этих данных следует, что денатурацию действительно можно трактовать как термодинамический конформационный переход и что нативная структура белка отвечает если не глобальному, то относительному минимуму свободной энергии. [c.249]

Важной является проблема обратимости денатурации, т. е. возможность вновь получить белок с исходной пространственной структурой и биологическими свойствами. Такой процесс называется ренатурацией. Впервые полную ренатурацию белка удалось осуществить на примере рибонуклеазы (К. Аифинсен, 1961). [c.105]

В ходе того же эксперимента было получено еще одно доказательство точности свертывания рибонуклеазы при ее ренатурации. Оказалось, что восемь остатков цистеина, образ овавщихся в реакции восстановления остатков цистина в полностью развернутой рибонуклеазе, постепенно окисляются под действием атмосферного кислорода, в результате чего образуются четыре внутрицепочечные дисульфидные связи точно в тех же положениях, что и в исходной нативной рибонуклеазе. Это замечательное явление. Случайная комбинация восьми остатков цистеина с образованием остатков цистина теоретически может дать 105 различных вариантов, однако в ходе ренатурации реализуется один-единственный специфический набор дисульфидных поперечных связей, характерный для нативной рибонуклеазы (рис. 8-8). Таким образом, полипептидная цепь денатурированной рибонуклеазы свертывается очень точно, что и приводит к формированию уникальной биологически активной конформации, исключая образование какой бы то ни было неправильной конформации. Этот классический эксперимент, выполненный Кристианом Анфинсеном в 50-х годах, доказал, что аминокислотная последовательность полипептидной цепи содержит всю информацию, необходимую для того, чтобы цепь свернулась в нативную трехмерную структуру. [c.197]

Регулярные структуры, возникающие на ранней стадии ренатурации, переходят с изменением или без существенных изменений в третичную структуру. Все аминокислоты были разделены на три группы, которым приписаны значения s = 0,385 (спиралеразрушающие остатки Gly, Pro, Ser, Asn), s = 1,00 (индифферентные - Phe, Туг, Lys, Arg, ys, Asp) и s = 1,05 (спиралеобразующие) значение а во всех случаях считалось неизменным. Были построены профили вероятности спирального содержания для 11 белков, которые затем сопоставлены с наблюдаемыми структурами. Полученное совпадение нельзя назвать удовлетворительным. Например, у папаина (211 остатков) в спиральные конформации входят 44 остатка правильно предсказаны 33, неправильно - 70. У рибонуклеазы А (124 остатка) в а-спиралях содержится 24 остатка правильно предсказано 18, неправильно - 36. Подобная картина имеет место и у других белков. Остатки, не включенные в спирали, были отнесены к клубковому состоянию, т,е., по существу, остались неидентифицированными. [c.252]

Однако исследование кинетики свертывания рибонуклеазы А, проведенное Болдвиным при различной вязкости растворителя, не обнаружило заметного влияния изменения скорости диффузии на скорость ренатурации белка [213]. Если не выходить за рамки эмбрионуклеационной модели, то эти данные можно объяснить свертыванием полипептидной цепи рибонуклеазы по механизму, в котором определяющими скорость процесса являются конформационные изменения эмбрионов перед их коалесценцией. [c.301]

Исследования Р. Болдвина и соавт. [56] и Т. Крейтона [83, 84] показали, что повторное свертывание рибонуклеазы с четырьмя правильными дисульфидными связями может происходить in vitro быстро, если придерживаться условий, близких к условиям укладки белковой цепи БПТИ. Для интерпретации промежуточных состояний и определения скорости образования S-S-связей ход процесса ренатурации рибонуклеазы, как и в случае БПТИ, блокировался на разных стадиях, выделялись промежуточные продукты и с помощью электрофоретической подвижности они анализировались. На начальном этапе сборки полипептидной цепи наблюдалась близкая аналогия в [c.374]

Более быстрое образование третьей и четвертой дисульфидных связей происходит при использовании в качестве дисульфидного реагента окисленного глутатиона (S-S-глутатиона). Однако, как видно из рис. III. 11, и в этом случае ренатурация не достигает состояния N. Рибонуклеаза принимает полностью нативную конформацию после медленного внутримолекулярного перераспределения S-S-связей в три-S-S-продуктах (Ш) и последующего тиолкатализируемого перераспределения TeTpa-S-S-продуктов (IV). Полупериоды конформационных переходов, завершающихся образованием промежуточных продуктов с одной (I), двумя (II), тремя (Ш) и четырьмя (IV) дисульфидными связями, согласно Крейтону, равны 2 10 , 3 10 , 1 и 20 с соответственно [83-85]. Следовательно, образованные вначале у восстановленной рибонуклеазы дисульфидные связи не только не благоприятствуют образованию следующих, а, напротив, препятствуют этому. В процессе ренатурации БПТИ полупериоды накопления [c.375]

Рис. ШЛО. Денситометрические кривые электрофоретического разделения молекул, фиксированных йодацетамидом (а) и йодацетатом (б) в процессе ренатурации панкреатической рибонуклеазы с использованием в качестве дисульфидного реагента дитиотреитола [83]

С. Шаффер [87], исследуя процесс ренатурации рибонуклеазы с помощью 8-8-глутатиона, обнаружил, что образование моно- и ди-8-З продуктов практически не сказывается на кривых кругового дихроизма, при последующем появлении и накоплении продуктов с большим числом дисульфидных связей они приближаются к спектру нативного белка. В связи с тем, что в данном случае изменения в спектрах кругового дихроизма, как и в случае изменений поглощения и флуоресценции, отмеченных Р. Хантгеном и соавт. [81], происходили раньше восстановления ферментативной активности рибонуклеазы, то, как полагает Крейтон, они связаны главным образом с формированием у три- и тетра-8-8-производных вторичных структур и гидрофобного окружения у ароматических остатков, а не с завершением образования нативной конформации. С. Шаффер и соавт. [88] исследовали влияние среды на скорость свертывания белковой цепи рибонуклеазы с использованием окисленного и восстановленного глутатиона. Обнаружено, что действие нейтральных солей на скорость ренатурации [c.377]

Выводы Чавеца и Шераги [86], как и Шаффера [87, 88], не.согласуются с результатами и более поздних исследований Крейтона и соавторов рибонуклеазы А [89, 90] и рибонуклеазы Т1 [91] методами, использованными при изучении БПТИ. Здесь также обнаруживаются промежуточные 8-8-продукты, свидетельствующие о внутримолекулярной реорганизации дисульфидных связей по ходу ренатурации, такой же, как в случае трипсинового ингибитора. Не является в связи с этим неожиданным существование ферментов - дисульфидных изомераз, способствующих свертыванию БПТИ и быстрому образованию правильной системы дисульфидных связей [92, 93] (подробнее см. гл. 14). [c.378]

Много работ посвящено изучению ренатурации лизоцима, начавшемуся на современном уровне с исследования К. Эпштейна, и Р. Голдбергера [94]. Однако и в них, как и в случае рибонуклеазы, нет достаточной информации для однозначного ответа на вопрос об основных, принципиальных моментах механизма ед ртывания белковой цепи. Р. Брэдшоу и соавт. [95], а позднее В. Саксена и Д. Уетлауфер [67] использовали для изучения обратимой денатурации лизоцима реакцию тиол-дисульфидного обмена последние стали проводить ее с [c.378]

У. Андерсон и Д. Уетлауфер проследили развитие процесса ренатурации лизоцима с помощью восстановленного и окисленного глутатиона [97]. Скорость образования дисульфидных связей, по их данным, опережает, точно так же, как у рибонуклеазы, восстановление ферментативной активности. Тем не менее авторы предположили прямой путь реставрации нативной конформации лизоцима только через продуктивные метастабильные состояния, не требующие переориентации дисульфидных связей. Однако выводы авторов о механизме сборки лизоцима нельзя считать достаточно обоснованными. В работе не были локализованы дисульфидные связи в продуктах, образованных [c.378]

В 1972 г. Д. Сачс и соавт. [114] разработали иммунологический метод, который был использован для изучения процесса ренатурации белков, не содержащих дисульфидных связей. Метод основан на предположении о двухфазном механизме свертывания и идентификации конформационных состояний фрагментов нативной трехмерной структуры белка с помощью специально подобранных антител. Далее выявляются зависимости между константой равновесия предельных состояний (D и N) и константами связывания антител с белковыми фрагментами. Д. Сачс и соавт. [115] применили метод для определения константы равновесия N D стафилококковой нуклеазы, а Дж. Харрел и соавт. [116] и Б. Фурье и соавт. [117] — для изучения конформаций промежуточных состояний миоглобина. О характере получаемой при исследовании иммунохимического метода информации можно судить по результатам рассмотренной в разд. 9.4. работы Л. Чавеца и Г. Шераги [86], применивших его в исследовании ренатурации рибонуклеазы А. [c.385]

Дальнейшие исследования Болдуина (R. L. Baldwin) и др. позволили установить, что двухфазность кинетики ренатурации рибонуклеазы обусловлена наличием двух денатури- [c.228]

Установить однозначно, сушествуют ли состояния молекул, отличные от нативного и денатурированного, часто бывает весьма трудно, но все же, правильно подобрав методы исследования и систему, эту задачу можно решить. Мы уже обсуждали случаи, когда с помощью кинетических измерений и метода ЯМР удавалось обнаружить наличие более чем двух состояний. Для рибонуклеазы было показано, что процесс ренатурации состоит из двух стадий быстрой и медленной. Возникает вопрос не переходят ли некоторые типы денатурированных молекул в ходе быстрой стадии в состояние, в котором у них имеются упорядоченные участки, служащие центрами нуклеации при ренатурации В этом отношении представляют интерес данные, полученные Анфиисеном и др. при исследовании стафилококковой нуклеазы (149 остатков см. Sa hs et al., 1972). Используя иммунологический подход, они обнаружили, что изолированный фрагмент фермента (51 остаток) может принимать конформацию, похожую на ту, которую этот же фрагмент имеет в составе интактной молекулы. Интерпретация этих данных показала, что изолированный участок может переходить в конформацию N, подобную нативной переход в эту конформацию характеризуется константой равновесия (N )/(U) (где U — конформации статистического клубка), примерно равной 10 . Это в свою очередь позволяет предположить, что некоторые типы денатурированных молекул легко переходят в состояния, в которых у них имеются упорядоченные участки с теми же конформациями, что и в иативной структуре. [c.235]

Инструктивная теория предсказывала, что если молекула антитела будет развернута (денатурирована), а затем вновь свернется (ренатурируется), то ее специфичность будет утрачена. Этому предсказанию противоречили экспериментальные данные по ренату-рации рибонуклеазы, полученные в лаборатории Христиана Анфинсена ( hristian Anfmsen). Вспомним, что денатурированная рибонуклеаза спонтанно восстанавливает исходную трехмерную структуру, специфичность и каталитическую активность после удаления денатурирующего агента (разд. 2.12). Для ренатурации присутствие субстрата не требуется. Этот принципиально важный факт относительно рибону- [c.240]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология