Рибонуклеаза дисульфидные связи

Руль и Анфинсен в своей работе по определению положения дисульфидных связей использовали способность рибонуклеазы расщепляться субтилизином. Они установили следующие положения 5 — 5 мостиков 1—6, 3—7, 8—2 и 4—5. Рибонуклеаза является вторым (после инсулина) белком, строение которого расшифровано. [c.524]

Таким образом, наряду с главным доминирующим типом связи в белке NH— СО имеется еще вторая S—S-дисульфидная связь. Мостики S—S могут образовываться между различными цепями (например, в инсулине) или связывать отдельные звенья одной и той же цепи (например, в рибонуклеазе), или же вызывать образование циклов (см. стр. 527), например, в окситоцине и вазопрессине. [c.529]

В одноцепочечных молекулах существуют внутрицепочечные дисульфидные связи. Если имеется только один внутрицепочечный дисульфидный мостик, как, например, в окситоцине, вазопрессине, соматостатине, то говорят о моноциклических одноцепочечных молекулах. Одноцепочечную молекулу, содержащую много внутрицепочечных дисульфидных мостиков (гормон роста, рибонуклеаза и др.), называют полициклической. [c.204]

Доказать термодинамическую гипотезу свертывания очень трудно. Обычно полагают, что термодинамическая гипотеза подтверждается экспериментами по повторному свертыванию панкреатической рибонуклеазы [4351. В этих опытах восстановленная несвернутая рибонуклеаза повторно окислялась в присутствии 8 М мочевины причем образовывалась случайная система водородных связей. В результате получалось около 100 различных продуктов, каждый из которых характеризовался своим набором из 4 дисульфидных связей (возможны (2-4) /2 -4 = 105 систем связей S—S [436, 4371 кроме того, существуют различные теоретические возможности образования петель. Удаление мочевины и добавление меркаптоэтанола (рис. 4.3) приводило к постепенному и в конечном счете количественному образованию нативной структуры. Этот факт показывает, что исходя из 100 различных групп, находящихся в исходных конформациях, можно получить нативную структуру. Хотя это число и невелико, данный опыт свидетельствует об уникальности продукта свертывания, однако он не позволяет решить вопрос о локальном или глобальном минимуме. [c.182]

На примере рибонуклеазы (фермента, гидролизующего РНК) было показано, что дисульфидные связи могут восстанавливаться под действием избытка 2-меркаптоэтанола в водном растворе мочевины (рис, 11,13, а). Денатурированная полипептидная цепь рибонуклеазы теряет при этом ферментативную активность. После отмывания от реагентов денатурированная цепь рибонуклеазы постепенно окисляется кислородом воздуха и возвращается к исходной пространственной структуре (рис. П. 13, б). При этом у ренатурированной цепи рибонуклеазы почти полностью восстанавливается ферментативная активность. [c.372]

На последнем этапе формируется нативная конформация белковой молекулы, связанная с замыканием дисульфидных связей и окончательной стабилизацией белко-Рис. 3.10. Нативная структура ВОЙ конформации. Не исключена также не-рибонуклеазы специфическая агрегация частично сверну- [c.36]

Для объяснения других сил, удерживающих пептидные цепи, необходимо наглядно представить себе пространственную конфигурацию, которая называется третичной структурой. Третичная структура более жесткая и поддерживается связями различного характера между боковыми группами пептидных цепей. Наибольшее значение имеют дисульфидные связи — связи между двумя половинами остатка цистина. Предполагают, что существуют и другие связи — ионные, водородные и солевые [106], причем наличие некоторых из них было подтверждено экспериментально. Важность дисульфидных мостиков для придания жесткости третичной структуре доказана экспериментально и подтверждена блокированием функциональных групп. В дальнейшем это будет проиллюстрировано, в частности, в разделе, посвященном структуре рибонуклеазы. [c.385]

Процессы окисления или восстановления оказывают явное влияние на некоторые белки, особенно на белки, содержащие дисульфидные связи (например, инсулин, рибонуклеаза). Иногда [c.385]

Не всегда удобно относить дисульфидные связи к первичной структуре. В случае инсулина, в котором две полипептидные цепи (не обладающие активностью, если они отделены друг от друга) соединены друг с другом дисульфидными связями, такая классификация, по-видимому, разумна. Есть основания считать, что рибонуклеаза обладает ферментативной активностью лишь при наличии определенной системы четырех пар дисульфидных связей в ее молекуле. Если в качестве критерия выбрать ферментативную активность, то правильную систему дисульфидных связей в рибонуклеазе можно также рассматривать как часть первичной структуры. Вместе с тем в тех случаях, когда возможна сульфгидрил-дисульфидная реакция обмена по схеме [c.273]

Эксперименты показали, что после восстановления нативной рибонуклеазы, взятой в концентрации менее 0,1%, и последую щего ее окисления около 70% окисленного материала оказы-вается растворимым и активность этой растворимой фракции составляет от 80 до 100% активности нативного фермента. Осадок состоит, вероятно, из молекул, соединенных межмолекулярными связями. Окисление в присутствии мочевины не приводит к появлению активного продукта. Эти факты свидетельствуют о том, что характер свертывания молекулы белка предопределен ее аминокислотной последовательностью. Действительно, из 105 вариантов образования дисульфидных связей осуществляется только тот, при котором молекула обладает ферментативной активностью (не исключено все же, что имеется несколько активных модификаций рибонуклеазы). [c.279]

Таким образом, результаты этих опытов показывают, что конформация молекулы, обусловливающая ее ферментативную активность, полностью определяется последовательностью аминокислот в полипептидной цепи. Для того чтобы остатки цистеина соединились правильно, пе нужно никакого специального фермента. Образование специфических дисульфидных связей требуется, по-видимому, лишь для стабилизации активной конформации, а не для ее возникновения. В результате восстановления и последующего окисления рибонуклеазы образуется продукт, имеющий ту же ферментативную активность, ультрафиолетовый спектр, характеристическую вязкость, дисперсию оптического вращения и те же иммунологические свойства, что и нативный фермент. Пептидные карты, получаемые после ферментативного расщепления этих двух веществ, также идентичны. Если 6l.i расположение дисульфидных связей в нативной и реконструированной рибонуклеазе было различным, пептиды, содержащие такие связи, не могли бы попасть, на одинаковые места карты. [c.279]

В определенных условиях молекулу рибонуклеазы можно расщепить с помощью фермента субтилизина. При этом разрывается связь между 20-м (аланин) и 21-м (серии) остатками и образуется два пептида — короткий (называемый 5-пептидом), содержащий 20 остатков, и более длинный (называемый 5-белком) из 104 остатков. Поскольку первый остаток цистеина находится в молекуле на 26-м месте, отщепление 5-пептида, состоящего из 20 первых аминокислотных остатков, равнозначно отщеплению хвоста фермента. По отдельности ни хвост , ни 5-белок не проявляют ферментативной активности, но их экви-молярная смесь активна. Очевидно, несмотря на разрыв связи между 20-м и 21-м остатками, благодаря взаимодействию боковых цепей образуется активная третичная структура. Если, так же как это делалось в случае нативного фермента, восстановить, а затем вновь окислить 5-белок, то получающийся продукт ничем не отличается от первоначального 5-белка. После добавления к реконструированному 5-белку 8-пептида активность в большой степени восстанавливается. По-видимому, правильное образование дисульфидных связей происходит и в отсутствие 5-пептида. Однако он все же несет какую-то определенную функцию, так как в его присутствии уменьшается количество осадка, состоящего, как предполагают, из молекул, связанных поперечными связями. Если опыт по восстановлению и последующему окислению производится с раствором, содержащим как 5-пептид, так и 5-белок, процент растворимого активного материала оказывается более высоким. [c.280]

Уменьшение размеров рибонуклеазы после разрыва 8—8-свя-зей и блокирования ацетамидными группами не вызывает сомнения. Эти результаты примечательны тем, что более плотная упаковка возникает после нарушения третичной структуры, после ликвидации удерживающих третичную структуру белка дисульфидных связей. Причем скручивание белка в плотную упаковку происходит не только за счет тирозин-карбоксильных водородных связей, но и в результате участия амидных группировок, без которых этого эффекта не наблюдается, хотя макромолекула и не развертывается существенным образом. Полученные данные объясняют полную реактивацию рибонуклеазы при реокислении, наблюдавшуюся Анфинсеном и другими [10]. Вместе с тем подобное явление не следует рассматривать как универсальное, так как в ряде белков разрушение 8—З-связей вызывает столь значительное разворачивание макромолекулы и увеличение ее размера, что воспроизведение нативной структуры при реокислении из-за [c.198]

Изучить структуру белка на самом простом уровне — значит определить его первичную структуру, т. е. последовательность аминокислотных остатков в полипептидной цепи, а также природу и положение поперечных связей. Вторичная структура белка, т. е. наличие и характер спирализации полипептидной цепи, в значительной степени зависит от первичной структуры. Она, кроме того, зависит от pH и ионной силы раствора, а также от тех свойств среды, которые влияют на водородные связи и гидратацию белка. Третичная структура белка возникает в результате дальнейшего изгибания и скручивания полипептидной цепи, уже имеющей вторичную структуру. В некоторых случаях вторичная и третичная структуры всецело определяются первичной структурой белка. Если такие белки подвергать воздействию повышенной температуры или обработать мочевиной, кислотой, щелочью или другими агентами, которые нарушают вторичную и третичную структуру, не затрагивая первичной, то возможно самопроизвольное восстановление их конформации. Примером подобных белков может служить фермент рибонуклеаза. В этом случае последовательность аминокислот в полипептидной цепи определяет даже положение дисульфидных мостиков, так что если после воздействия восстанавливающими агентами провести окисление в мягких условиях, то-образование поперечных дисульфидных связей происходит в тех же местах, где они были раньше. Другие ферменты необратимо денатурируются даже в относительно мягких условиях. В настоящее время не ясно, каким образом столь лабильная и высокоспецифичная структура, как третичная, возникает во время синтеза ферментного белка на поверхности рибосомы. [c.99]

В настоящее время полностью расшифрована аминокислотная последовательность панкреатической рибонуклеазы (она состоит из 124 аминокислотных остатков). Субтилизин гидролизует пептидную связь между 20-м и 21-м аминокислотными остатками рибонуклеазы. Полученный пептид, состоящий из 20 аминокислотных остатков, способен обратимо отделяться от оставшейся части молекулы фермента. Удаление пептида сопровождается утратой активности, а его воссоединение с молекулой — за счет нековалентных связей — приводит к полному восстановлению активности фермента. Далее восстановление четырех дисульфидных связей молекулы рибонуклеазы вызывает полное разворачивание полипептидной цепи фермента. Когда при окислении кислородом дисульфидные связи снова образуются, происходит почти полное восстановление активности фермента. Таким образом, характер складывания полипептидной цепи должен опреде- [c.108]

То, что водородная связь образуется именно с карбоксильным ионом, а не с незаряженным карбоксилом, было доказано спектроскопически. При переходе от pH 1,5, когда СООН-группа не заряжена, к pH 5 происходит заметное смещение (на 6 ммк) полосы поглощения белка при 280 ммк, которое объясняется образованием водородной связи. Две такие связи были обнаружены в молекуле инсулина и три — в молекуле рибонуклеазы. Подобного рода связи играют важную роль в сохранении третичной структуры некоторых белков. Так, при обработке рибонуклеазы (5-меркаптоэтанолом в 8 М мочевине (агент, разрушающий водородные связи) происходили разрыв 5—5-мостиков и полная инактивация фермента. Однако после удаления этих агентов и окисления сульфгидрильных групп кислородом воздуха наблюдалось полное восстановление активности и числа 5—5-связей. Очевидно, что образование этих связей происходило в тех же местах, что и в нативном белке. Если же и окисление 5Н-группы проводилось в 8 М мочевине, то активность фермента не восстанавливалась, хотя и наблюдалось полное восстановление числа дисульфидных связей. Вероятно, восстановление этих связей проходило в полном беспорядке, хаотично, и белок остался денатурированным. [c.116]

Более быстрое образование третьей и четвертой дисульфидных связей происходит при использовании в качестве дисульфидного реагента окисленного глутатиона (S-S-глутатиона). Однако, как видно из рис. III. 11, и в этом случае ренатурация не достигает состояния N. Рибонуклеаза принимает полностью нативную конформацию после медленного внутримолекулярного перераспределения S-S-связей в три-S-S-продуктах (Ш) и последующего тиолкатализируемого перераспределения TeTpa-S-S-продуктов (IV). Полупериоды конформационных переходов, завершающихся образованием промежуточных продуктов с одной (I), двумя (II), тремя (Ш) и четырьмя (IV) дисульфидными связями, согласно Крейтону, равны 2 10 , 3 10 , 1 и 20 с соответственно [83-85]. Следовательно, образованные вначале у восстановленной рибонуклеазы дисульфидные связи не только не благоприятствуют образованию следующих, а, напротив, препятствуют этому. В процессе ренатурации БПТИ полупериоды накопления [c.375]

Примером может служить молекула рибонуклеазы, третичная структура которой фиксируется четырьмя дисульфид-ными мостиками (рис. 66). Если нативную (сохранившую свои природные свойства и, в частности, каталитическую активность) рибонуклеазу обработать мочевиной и меркаптоэта-нолом, то дисульфидные мостики разрываются — происходит денатурация с утратой биологической активности и изменением третичной структуры. После удаления реагентов, вызвавших денатурацию, рибонуклеаза под действием кислорода воздуха снова замыкает свои дисульфидные связи, принимая свойственную ей третичную структуру и вновь приобретая биологическую активность. [c.641]

Рибонуклеаза. — Одна из рибонуклеаз была выделена в кристаллическом виде из бычьей поджелудочной железы Купит-цем (1940). Панкреатическая рибонуклеаза гидролизует рибонуклео-тидные связи, в которых пиримидиновый нуклеозид этерифицирован по З -положению сахара. Этот фермент содержит 124 остатка аминокислот и четыре дисульфидные связи. Установление первичной структуры этого фермента Муром и Штейном (1960) явилось важной вехой в химии белка. Последовательность частично была определена на окисленной рибонуклеазе, которая при энзиматическом расщеплении дает 24 пептида. Их размеры позволяют непосредственно определить последовательность химическими и ферментативными методами. Наконец, ферментативный гидролиз нативного белка, разделение содержащих цистин пептидов, окисление их до цистеиновых пептидов и аминокислотный анализ последних позволили выяснить, каким образом восемь по-луци1стинооых о статков связаны друг с другом (рис. 27, стр. 740). [c.739]

Параллельно с определением последовательности аминокислотных остатков в рибонуклеазе проводилось и определение положения дисульфидных мостиков. Спакман, Мур и Штейн нашли, что рибонуклеазу можно гидролизовать трипсином и химотрипсином без предварительного окисления дисульфидной связи, если проводить гидролиз в 2-мо-лярном растворе хлоргидрата гуанидина. Ими было получено-6 пептидов, которые затем подвергались окислению надмуравьиной кислотой и исследовались. Таким образом было установлено, что 5—8 мостики расположены в положениях 1—б, 2—7, 3—8 и 4—5. [c.524]

Методы белкового синтеза развиты в настоящее время в такой степени, что ферменты, молекулы которых имеют небольшие размеры, могут быть синтезированы в лабораторных условиях. Это дает возможность создавать новые модифицированные ферменты и критически анализировать роль различных групп активного центра. Так, например, установлено, что построенный из 70 аминокислотных остатков синтетический пептид, аналогичный рибонуклеазе 5, но несущий ряд делеций и, совершенно не содержащий дисульфидных связей, все же сохраняет заметную каталитинескую активность [61]. [c.121]

Для полного восстановления обычно необходимо использовать тиол и реагент, вызывающий разрыв водородных связей, а следовательно, и разделение пептидных цепей. Так, инсулин полностью восстанавливается только тногликолятом в присутствии 8 М раствора мочевины [202], а электрофорез на бумаге в 8 М растворе мочевины позволяет разделить две полипептидные цепи. В отсутствие мочевины цистин восстанавливается не более чем на з- Степень восстановления дисульфидных связей рибонуклеазы [282] также определяется концентрацией мочевины. Тиогликолят при pH 7 в отсутствие поверхностно-активного вещества [209] или гуанидина [171] восстанавливает только одну цистиновую связь из 17 связей, имеющихся в альбуминах человека и быка (мол. вес 65 000). В 0,2 М растворе натриевой соли децилсульфата при pH.7 в течение 1 час при комнатной температуре восстанавливаются все цистиновые связи. [c.172]

Свертывание может происходить значительно быстрее, чем синтез цепи. Свертывание in vitro осуществляется чрезвычайно быстро, по крайней мере для малых белков, не содержащих дисульфидных мостиков. Нуклеаза стафилококка повторно свертывается в течение 1 с [438], а метмиоглобин — в течение 10 с [439]. Если эти величины применимы также и к условиям in vivo, свертывание цепи может происходить по крайней мере в 10 раз быстрее, чем биосинтез аминокислотной последовательности. Дисульфидсодержащие белки, например панкреатическая рибонуклеаза, повторно свертываются за время от 1 до 10 с, если дисульфидные связи не были разорваны в процессе предшеств ющей денатурации [440]. Однако если такие белки развернуты и восстановлены, последующее свертывание цепи (которое включает образование правильной системы дн-сульфидных связей) продолжается при оптимальных условиях в течение многих минут. [c.182]

Эксперименты по повторному свертыванию выявляют быстро и медленно свертывающиеся цепи. Подразделение несвернутых цепей на два класса, быстро и медленно свертывающихся, было-установлено при исследовании рибонуклеазы [440, 447, 448]. В опытах по повторному свертыванию рибонуклеазы, денатурированной без нарушения системы дисульфидных связей, было обнаружено, что 20% цепей повторно свертываются в пределах 0,1 с (быстро свертывающиеся цепи.) Процентное содержание таь их цепей не зависит от способа денатурации (гуанидин гидрохлорид [449], нагревание-[450] и т. д.). Остальные 80% цепей (медленно свертывающихся) превращаются за время от 10 до 100 с в быстро свертывающиеся, которые затем укладываются моментально. Имеется сообщение об-аналогичном, хотя и менее количественном наблюдении в отношении ингибитора трипсина поджелудочной железы быка (BPTI), в котором 15% цепей свертывались значительно медленнее, чем остальные [451]. Это явление пока еще не объяснено. Согласно одной из гипотез [449, 452], в быстро свертывающихся цепях все пептидные-связи представлены правильными цис-транс-тоы 1 аш, тогда как медленно свертывающиеся цепи содержат неправильные изомеры . [c.184]

Зная строение пептидов, полученных при гидролизе различными ферментами, можно установить первичную структуру белка, решая задачи типа кроссвордов. В настоящее время установлены первичные структуры тысяч белков. Их сводки систематически публикуются в атласе белковых структур. На рис. 2.2 и 2.3 изображены первичные структуры рибонуклеазы быка и миогло-бина кашалота. В первом случае имеются четыре дисульфидные связи, соединяющие друг с другом остатки Цис. [c.33]

Естественно, что полной обратимости денатурации следует ожидать для белков, не содержащих групп, вступающих в денатурированном состоянии в необратимые реакции (например, окисление 5 — Н-групп) [101]). Так, доказана обратимость денатурации рибонуклеазы [135], такаамилазы А [136] и а-амилазы [136]. В работах Анфинсена и др. [137—140] показано, что можно добиться ренатурации белков и с разорванными дисульфидными связями. Из этих данных следует, что денатурацию действительно можно трактовать как термодинамический конформационный переход и что нативная структура белка отвечает если не глобальному, то относительному минимуму свободной энергии. [c.249]

Значительно более сложная ситуация возникает при синтезе соединений с несколькими дисульфидными связями. Например, если в пептиде содержится 6 остатков цистеина <3 дисульфидных связи, как в рибонуклеазе А), то формально возможно образование 105 структурных изомеров с разными дисульфидными связями. В этом случае направление и полнота реакции обычно определяются специфической укладкой пептидной цепи, что позволяет проводить самопроизвольное окислительное замыкание нужных дисульфидных связей. Естественно, здесь требуется тщательный подбор условий окислитель, концентрация, pH среды, температура, причем даже в оптимальных условиях выход целевого продукта невысок и не исключается образование пббочных соединений. [c.154]

В противоположность инсулину, нри окислении которого надмуравьиной кислотой образуются два фрагмента, окисление дисульфидных связей в рибонуклеазе указывает на наличие одной пептидной цепи [4]. Было предположено, что в отсутствие сульф-гидрильных групп пептидная цепь находится в виде клубка, причем четыре дисульфидных мостика соединяют между собой восемь полуцистиновых пептидных фрагментов. При окислении метионин превращался в сульфон. Во избежание образования побочных хлорнроизводных тирозина [77] необходимо удаление ионов хлора. [c.414]

Устойчивость цистин-содержащих белков к нагреванию. Большинство глобулярных белков при кратковременном нагревании до 65°С денатурирует (претерпевает процесс разворачивания цепей) с полной потерей активности. Однако те глобулярные белки, в которых содержится много остатков цистина, денатурируют только при более длительном нагревании до более высоких температур. Одним из таких белков является рибонуклеаза, содержащая 124 аминокислотных остатка в единственной полипептидной цепи, в которой имеется четьфе поперечные дисульфидные связи, образованные остатками цистина. Чтобы полипептидная цепь рибонуклеазы развернулась, необходимо нагреть содержащий ее раствор до высокой температуры если затем быстро охладить его, то ферментативная активность восстанавливается. Можете ли вы указать молекулярную основу такого поведения [c.185]

В ходе того же эксперимента было получено еще одно доказательство точности свертывания рибонуклеазы при ее ренатурации. Оказалось, что восемь остатков цистеина, образ овавщихся в реакции восстановления остатков цистина в полностью развернутой рибонуклеазе, постепенно окисляются под действием атмосферного кислорода, в результате чего образуются четыре внутрицепочечные дисульфидные связи точно в тех же положениях, что и в исходной нативной рибонуклеазе. Это замечательное явление. Случайная комбинация восьми остатков цистеина с образованием остатков цистина теоретически может дать 105 различных вариантов, однако в ходе ренатурации реализуется один-единственный специфический набор дисульфидных поперечных связей, характерный для нативной рибонуклеазы (рис. 8-8). Таким образом, полипептидная цепь денатурированной рибонуклеазы свертывается очень точно, что и приводит к формированию уникальной биологически активной конформации, исключая образование какой бы то ни было неправильной конформации. Этот классический эксперимент, выполненный Кристианом Анфинсеном в 50-х годах, доказал, что аминокислотная последовательность полипептидной цепи содержит всю информацию, необходимую для того, чтобы цепь свернулась в нативную трехмерную структуру. [c.197]

Среди ковалентных связей, видимо, наиболее широко распространен только один тип — днсульфидная связь, которая может соединять разные части одной полипептидной цепи, например в рибонуклеазе или лизоциме [25, 26], или разные полипептидные цепи, например в инсулине [25], Y-глoбyлинe [27] и химотрипсине [28, 29]. Инсулин, у Глобулин и химотрипсин содержат не только внутрицепочечные, но и межцепочечные дисульфидные связи . [c.391]

Наиболее убедительным доказательством того, что первичная структура определяет вторичную и третичную, могут, по-видимому, служить опыты по восстановлению нативной структуры белка после денатурации ренатура-ция белка). Если, например, полностью развернуть молекулу рибонуклеазы путем восстановления четырех ее дисульфидных мостиков меркаптоэта-нолом в 8 Af мочевине, а затем вызвать реокисление таких развернутых молекул в контролируемых условиях, то молекулы (от 95 до 100%) вновь приобретают нативную конформацию, что подтверждается восстановлением не только физических свойств, но и ферментативной активности. Этот опыт схематически представлен на фиг. 42. Статистические расчеты показывают, что если бы реконструкция дисульфидных мостиков происходила совершенно произвольно, то нативную конформацию приобретало бы лишь небольшое число молекул —около 1%. В табл. 20 приведены данные по рена-турации некоторых белков. Во всех случаях, за исключением инсулина, степень восстановления нативных структур значительно превышает величину, которой следует ожидать, исходя из статистических соображений. Эти данные вовсе не означают, однако, что процесс образования дисульфидных связей в белках может протекать in vivo без направленного катализа. Реконструкция нативных белковых структур после восстановительного разрыва дисульфидных мостиков представляет собой слишком медленный процесс, не соответствующий скорости синтеза биологически активных белков [c.113]

Подвергая нативную рибонуклеазу действию меркаптоэта-нола в присутствии мочевины, можно восстановить четыре специфические дисульфидные связи до свободных сульфгидрильных групп и разрушить вторичную и третичную структуру молекулы. Молекула восстановленной рибонуклеазы не обладает ферментативной активностью и состоит из одной полипептидной цепи, содержащей восемь остатков цистеина. Присутствие мочевины в данном случае существенно, так как дисульфидные связи не восстанавливаются, пока сохраняется вторичная и третичная структура. При окислении восстановленной рибонуклеазы с помощью кислорода в отсутствие мочевины в молекуле вновь образуются дисульфидные связи. Если бы при этом была возможна любая комбинация цистеиновых остатков, то всего существовало бы 105 вариантов расположения дисульфидных мостиков в реконструированной молекуле, т. е. вероятность образования системы связей, соответствующей нативному ферменту, была бы меньше 1%. Этот расчет является слишком упрощенным, поскольку мы не учитывали, что распределение остатков цистеина по цепи неравномерно и вероятность связывания соседних сульфгидрильных групп должна быть больше, чем для отдаленных друг от друга групп. Следовательно, некоторые из этих 105 вариантов более вероятны, но это не влияет существенно на результат. Итак, если фермент активен только в конфигурации, которая идентична нативной, и образование дисульфидных мостиков происходит хаотическим образом, то после восстановления и последующего окисления рибонуклеазы ее активность должна равняться примерно 1 % от исходной. Если же дисульфидные связи образуются некоторым специфическим образом, то после окисления активность должна быть равна 1QQВ дея- [c.278]

Сравнение скоростей исчезновения сульфгидрильных групп и изменения оптического вращения при окислении восстановленной рибонуклеазы со скоростью восстановления ферментативной активности показало, что сначала наблюдается зависящий от концентрации период индукции, в течение которого скорость восстановления ферментативной активности отстает от скорости исчезновения сульфгидрильных груг(п и уменьшения вращения. Посредством химического анализа было установлено, что- на этом этапе образуются межмолекулярные дисульфидные связи, которые затем исчезают в результате сульфгидрил-ди-сульфидных реакций обмена, приводящих к образованию термодинамически выгодной нативной структуры. О том же свидетельствуют эксперименты, показавшие, что рибонуклеаза, утра- [c.279]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология