Определение числа дисульфидных связей

Уникальные свойства белков определяются не только количественными соотношениями между различными аминокислотами, но и определенной последовательностью их расположения в полипептидных цепочках. Аминокислотный состав белка и последовательность расположения аминокислот в полипептидных цепочках называют первичной структурой белка. Первичная структура белка, помимо пептидных связей, содержит также некоторое число дисульфидных мостиков. Исследовать первичную структуру — это значит 1) определить число полипептидных цепей и установить, являются ли они открытыми или замкнутыми, 2.) установить линейную последовательность (порядок чередования) аминокислот в отдельных полипептидных цепях (или цепи) и 3) определить число и местоположение поперечных дисульфидных мостиков, соединяющих эти цепи в молекуле белка. Очевидно, что для разрешения этой задачи необходимо прежде всего иметь очищенные, гомогенные препараты белка, поскольку даже незначительная примесь посторонних белков может существенно исказить получаемые результаты. Кроме того, в распо- [c.77]

Определение числа и местоположения дисульфидных связей [c.86]

Определение числа дисульфидных связей [c.168]

Для определення числа дисульфидных связей в белке требуется 1) восстановить дисульфидные связн до меркаптогрупп, 2) получить производные этих групп с ДТНБ, 3) провести гидролиз пептидных связей, 4) измерить количество образовавшегося производного ДТНБ. б) Каким еще операциям следует подвергнуть белок для того, чтобы точно определить число дисульфидных связей в нем в) Как это можно осуществить [c.417]

Восстановление дисульфидных групп. Восстановление дисульфидных связей осуществляется в нейтральной или слабощелочной среде с помощью избытка какого-либо тиосоединения (цистеина, глютатиона, р-меркаптоэтанола и т. п.). Реакция максимально специфична и легко обратима за ее ходом можно следить путем определения числа ЗН-групп, возникающих в белке, или количества израсходованного тиосоединения. [c.66]

Денатурация белка в классическом смысле определялась как любая непротеолитическая модификация уникальной структуры нативного белка, приводящая к определенным изменениям химических, физических и биологических свойств [388]. Из этого определения исключаются изменения состояния ионизации, если только они не сопровождаются конформационными переходами. Денатурация может происходить в результате нагревания, изменения pH и добавления неполярных растворителей или некоторых специфических денатурирующих реагентов, например мочевины или солей гуанидина. Она также может быть вызвана восстановительным или окислительным разрывом дисульфидных связей, которые стабилизуют нативные конформации некоторых белков. Денатурация, как правило, сопровождается уменьшением растворимости белка. Это можно легко понять, так как гидрофобное взаимодействие, стабилизующее нативную конформацию, приводит к межмолекулярной агрегации, если полипептидные цепи принимают вытянутые конформации. Другим характерным последствием денатурации является раскрытие реакционноспособных групп, которые расположены внутри третичной структуры и становятся доступны воздействию реагентов при разрушении этой структуры. К числу наиболее пригодных методов наблюдения за процессами денатурации принадлежат спектроскопические измерения, измерения оптической активности и определение каталитической активности ферментов или биологической активности гормонов. Конформационные переходы при денатурации включают ряд процессов, которые в различной степени могут сказываться на каждом из наблюдаемых изменений, и поэтому понятие степени денатурации бессмысленно, если не будет установлен критерий, с помощью которого денатурация измеряется. Эта точка зрения иллюстрируется рис. 44, на котором изображено изменение оптической активности, поглощения света и ферментативной активности рибонуклеазы [389]. [c.136]

При рассмотрении механизма ренатурации БПТИ состояние белковой цепи на пути от статистического клубка к нативной конформации оценивалось, следуя Крейтону [7], по дисульфидным связям (см. рис. IV. 17), Считалось, что чем больше их число и чем ближе они подходят к системе дисульфидных связей конечной структуры, тем дальше продвинулся процесс сборки. При экспериментальном изучении ренатурации белков альтернативного, столь же надежного способа идентификации структуры промежуточных метастабильных состояний практически нет. Действительно, дисульфидная связь является удобным критерием. Она указывает на сближенность определенных участков белковой цепи на этапах свертывания, надежно характеризует как исходное, полностью денатурированное состояние, так и конечную, нативную трехмерную структуру. И тем не менее способ идентификации промежуточных состояний только по дисульфидным связям не может пролить свет на многие важные детали механизма ренатурации и ответить на поставленные вопросы. Возникновение этих связей является следствием, а не причиной самоорганизации белковой цепи. [c.480]

Эти опыты показывают, что программа самосборки белка закодирована в его первичной структуре. По всей вероятности, важное значение при ренатурации белка имеет образование ядер , т. е. небольших участков упорядоченной вторичной структуры (стадия нуклеации). За этим сравнительно медленным процессом следует быстрое сворачивание цепи в нативную структуру. На первых этапах ренатурации белков, в поддержании нативной конформации которых участвуют дисульфидные мостики, образуются промежуточные производные с правильными и неправильными дисульфидными связями. В ряде случаев удавалось останавливать процесс ренатурации на определенных стадиях и выделять такие частично свернутые формы. Поскольку в целом сборка белка является достаточно быстрым процессом, можно сделать вывод о том, что природа не перебирает все возможные комбинации в очередности замыкания дисульфидных мостиков (при 4 S—S-связях их 105, а при 5 — уже 945), а сворачивание полипептидной цепи идет по ограниченному числу направлений и приводит к конформации, характеризующейся минимальной свободной энергией. [c.105]

При электрофорезе в полиакриламидном геле заряд белков не играет решающей роли в определении подвижности данной макромолекулы — особенно при электрофоретическом разделении кислых белков, обычно диспергированных в 0,1%-ном растворе додецилсульфата натрия. В этих условиях основные группы белка образуют комплексы с додецилсульфатом натрия и благодаря этому белки, подобно нуклеиновым кислотам, ведут себя главным образом как полианионы. Разделение в этом случае происходит в основном за счет различий в молекулярных весах, причем более мелкие компоненты движутся впереди более крупных. Путем стандартизации таких гелей с помощью белков или нуклеиновых кислот известного молекулярного веса можно с достаточной точностью определить молекулярный вес неизвестных компонентов [435]. Следует особо отметить, что если исследуемый белок состоит из двух или большего числа цепей, связанных друг с другом дисульфидными связями, и если разделение при этом проводят, как обычно, в присутствии сильных денатурирующих и восстанавливающих агентов, то полученные данные относятся к молекулярным весам структурных субъединиц или даже пептидных цепей. [c.62]

Обычно время полужизни белков составляет от нескольких минут до нескольких часов. Такая вариабельность обусловливается различиями в числе дисульфидных связей в белковых молекулах и наличием или отсутствием на 5 "-конце определенных аминокислот. Например, если к N-концу -галактозидазы присоединять разные аминокислоты, то время жизни модифицированного белка in vitro может варьировать от двух минут до более 20 часов (табл. 6.4). Аминокислоты, увеличивающие время жизни белков, можно включать в белки генноинженерными методами. Часто для стабилизации белка-мищени достаточно присоединить к N-концу всего [c.121]

Для однозначной идентификации положения дисульфидных связей важно, чтобы каждый из цистинсодержащих пептидов включал только один дисульфидный мостик. Предварительно необходимо установить число и положение в полипептидной цепи остатков цистеина поэтому к анализу приступают лишь после определения полной аминокислотной последовательности полипептидной цепи или цепей исследуемого белка. Число дисульфидных связей можно определить с помощью различных методов. Для этого наряду с установлением первичной структуры проводят исследование физико-химических свойств белка. Данные относительно внутри- и межцепочечных дисульфидных [c.166]

Упомянутые авторы сходятся во мнении, что такая двумерная структура наиболее устойчива. Наличие дисульфидной связи между определенными субъединицами кислотного и основного типов [32, 60], помимо водородных, гидрофобных и электростатических взаимодействий, несомненно, вносит дополнительный вклад в сохранение и устойчивость этой структуры. Дрэйпер и Кацимполас [32] обнаружили в 8 М растворе мочевины 20 дисульфидных мостиков на молекулу. По их данным, эти связи малодоступны, потому что установленное число 5—5 есть линейная функция концентрации мочевины в среде, обеспечивающей растворимость. [c.160]

Такой механизм обусловлен предрасположенностью фрагмента к формообразованию, автоматически приводящему к сближенности определенные остатки ys. Результаты расчета фрагмента AIa - ys уменьшили число возможных для молекулы инсектотоксина систем дисульфидных связей с шести до двух [c.320]

При учете локализации S-S-мостика конформационный анализ цистин-содержащего фрагмента природного олигопептида или белка может быть ограничен рассмотрением его состояний только с замкнутыми формами основной цепи. Значительное сокращение объема вычислительных работ не сопровождается при этом снижением требований к строгости рещения задачи. В этом случае для пептида определенной длины необходимо располагать набором соответствующих циклических структур с известными геометрическими и энергетическими характеристиками. Он может быть получен путем количественной оценки стерической и энергетической предрасположенности всех возможных конформаций модельного пептида того же размера ys -(Ala) 2 ys" к образованию дисульфидной связи. В работах В.З. Спасова и Е.М. Попова [106, 107] оценены конформационные возможности модельных олигопептидов с числом остатков л от двух до шести. При большей длине цепи с концевыми остатками ys предложенный метод становится малоэффективным. [c.326]

ЛИ, которую играют в поддержании структуры те или иные связи, различают несколько структурных уровней. Первичная структура белка определяется числом и последовательностью ковалентно связанных аминокислот. Полипептидная цепь благодаря водородным связям, образующимся между кислородными атомами карбонильных групп и азотными атомами амидных групп, приобретает вторичную структуру она может образовать спиральную конфигурацию (а-спираль) или конфигурацию так называемого складчатого слоя. Третичной структурой называют определенное пространственное расположение пептидной цепи, обусловленное взаимодействием между различными ее боковыми группами. В поддержании третичной структуры участвуют другие водородные связи, ионные связи и неполярные (гидрофобные) взаимодействия. Поперечные связи, соединяюище различные участки полипептидной цепи, могут быть и ковалентными таковы, например, дисульфидные связи, образующиеся при окислении SH-rpynn. И наконец, благодаря взаимодействиям нескольких полипептидных цепей могут возникать надмолекулярные агрегаты. Такое строение (при котором белок состоит из определенного числа полипептидных цепей, или субъединиц) называют четвертичной структурой. При физиологических условиях белок находится в водной фазе. Поэтому между белками и диполями воды тоже имеет место взаимодействие. Полярные группы гидратированы. Факторы, вызывающие изменение заряда белков (концентрации ионов Н, Са , Mg , К и др.), неизбежно влияют также на степень гидратации, а тем самым и на степень набухания белков. [c.43]

В местах локализации дисульфидных мостиков создаются напряжения, ослабляющие водородные связи и нарушающие спиральную структуру. Это подтверждается опытами по определению скорости дейтерации белков. Так, у того же инсулина из 30 медленно обменивающихся при 0° атомов водорода 7 начинают обмениваться быстро при 20°. (Очевидно, что к их числу относятся водородные атомы тех пептидных групп, которые близко расположены к дисульфидным мостикам и потому слабо связаны водородными связями. Таким образом, наличие дисульфидных связей приводит к тому, что наряду со спиральными участками в полипептидных цепях имеются аморфные участки, придающие им определенную гибкость. Вместе с тем эти же мостики связы- [c.92]

Во многих случаях можно предполагать, что каждая субъединица образована одной полипептидной цепью. Если это не так, то можно подобрать условия, при которых все индивидуальные полипептидные цепи в четвертичной структуре разделяются. Для разделения обычно используют сильные денатурирующие агенты, такие как додедилсульфат натрия, и обработку восстанавливающими агентами для разрущения всех дисульфидных связей. Часто все получающиеся остатки цистеина алкилируют иодуксусной кислотой или иодацетамидом для предотвращения восстановления дисульфидных связей при последующих измерениях. Методы разделения почти всегда дают возможность определить число различных типов полипептидных цепей. Например, с помощью электрофореза часто разделяют белки, которые абсолютно идентичны, за исключением единичных зарядовых различий. Молекулярную массу каждой из денатурированных цепей (Л/ ) можно определить гидродинамическими методами, хотя и не всегда с такой же точностью, как в случае нативных белков. В качестве альтернативы используют химические методы для определения числа аминокислот, приходящегося на один Ы-конец. Вместе с аминокислотным анализом это дает возможность достаточно точно определить молекулярную массу цепи. [c.130]

Третичная структура белковой молекулы представляет собой трехмерные образования между полипептидными цепями. Спирали винтовой структуры белковой молекулы определенным образом изогнуты и упакованы в относительно жесткие конформации. Устойчивость конформации третичной, а также четвертичной структуры обусловлена большим числом водородных, дисульфидных, ван-дер-ваальсовых и ионных связей. [c.32]

Общепринято, что вулканизация серой приводит к образованию между полимерными цепями поперечных связей типа R—— —R, гдеН—углеводород каучука, ах — индекс, равный или превышающий единицу и указывающий на число атомов серы в поперечной связи. Среднее значение х, как и следовало ожидать, зависит от вида и количества используемого ускорителя. Фармер в 1946 г. сделал обзор данных о процессах, протекающих при вулканизации, и пришел к выводу, что вулканизация является результатом свободнорадикальной цепной реакции, включающей взаимодействие радикалов серы с а-метиленовыми атомами водорода в молекулах каучука. Он писал Наши сведения об особенностях химического действия серы на полиолефины, о превращениях ускорителя при вулканизации и о влиянии окиси цинка на эти процессы слишком ограничены, чтобы прийти к окончательному выводу о точном химическом механизме серной вулканизации. Имеющиеся сведения показывают, что сера определенно служит для соединения простых моно- и диолефинов друг с другом, и поэтому можно ожидать, что она свяжет между собой большие полиолефиновые молекулы кроме того, поскольку уменьшение ненасыщенности при образовании малосерных вулканизатов натурального каучука сравнительно невелико, имеется основание предположить, что многие поперечные связи образуются у а-метиле-новых углеродных атомов. Поперечные связи, по-видимому, представляют собой главным образом сульфидные и дисульфидные мостики при отсутствии сколько-нибудь значительного количества непосредственных углерод-углеродных связей. Минимальное количество поперечных связей, необходимое для поддержания определенных свойств вулканизата, неизвестно, но не может быть очень большим. Пригодность органического химического ускорителя, вероятно, связана, во-первых, с особенностями его термического распада в условиях вулканизации и, во-вторых, способностью его атома азота или атомов азота и серы вступать в координационные связи. Первое из этих качеств можно использовать [c.189]

ДО полного изменения в расположении пептидных цепей. Развертывание пептидных цепей при денатурации подтверждается тем, что денатурированные белки дают более интенсивные цветные реакции, чем нативные белки. Это было впервые установлено для реакций на сульфгидрильные группы цистеина и на дисульфидные группы цистина [136]. Реакция с нитропуссидом, титрование железосинеродистым калием [39], ацетилирование [137] и полярография [138] — все эти методы определения сульфгидрильных и дисульфидных групп показали, что число этих групп в денатурированных белках больше, чем в тех же белках, находящихся в нативном состоянии. Денатурированные белки дают также более интенсивные цветные реакции на тирозин с фосфорномолибденовой кислотой [139, 140] и с диазореактивом [141], а на аргинин с реактивом Сакагуши [142] и присоединяют большие количества иода [143]. В то время как в нативном лакто-глобулине только 12 -аминогрупп лизина реагируют с динитрофторбензолом, в денатурированном лактоглобулине эту реакцию дает 31 е-аминогруппа, т. е. все содержащиеся в нем е-аминогруппы [144]. Таким образом, все приведенные данные подтверждают ту точку зрения, что при денатурации в связи с развертыванием пептидных цепей становятся доступными те активные группы, которые в нативных белках недоступны для соответствующих реактивов. Подобным же образом можно объяснить меньшую устойчивость ряда денатурированных белков по отношению к действию трипсина. Как известно, многие денатурированные белки гораздо легче расщепляются трипсином, чем те же самые белки в нативном состоянии. Это можно рассматривать как следствие того, что при денатурации разрываются связи, тесно удерживающие пептидные цепи друг около друга, и обнажаются те пункты, на которые может воздействовать фермент [146, 147]. Можно полагать, что трипсин, гидролизуя (хотя и медленно) нативные белки, гидролизует, в сущности, содержащиеся в них следы денатурированных белков. При этом процессе должно происходить непрерывное нарушение равновесия в системе нативный белок—денатурированный белок и смещение этого равновесия в правую сторону. [c.149]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология