Идентификация оснований нуклеиновых кислот

Идентификация оснований нуклеиновых кислот [51. 57, 203] [c.51]

Общее строение нуклеиновых кислот строго доказано. При гидролизе нуклеиновые кислоты распадаются на соответствующие нуклеотиды. Место связи рибозы с фосфорной кислотой установлено с помощью избирательного гидролиза. При этом в зависимости от природы фермента получают нуклеозид-5 -монофосфат, или нуклеозид-3, 5 -ди-фосфат, или нуклеозид-З -монофосфат, откуда следует, что остатки рибозы связаны в нуклеиновых кислотах фосфорной кислотой в положении 3,5. Природа оснований установлена путем их идентификации в продуктах гидролиза нуклеотидов. Наконец, нуклеиновые кислоты титруются как одноосновные кислоты. Это указывает на то, что две гидроксильные группы фосфорной кислоты связаны с двумя остатками рибозы. [c.361]

Необходима высокая степень молекулярной гомогенности анализируемой нуклеиновой кислоты. Примеси вызывают высокий фон, который уменьшает достоверность идентификации основания, отщепляющегося в конце каждого цикла. [c.116]

Максимальная разрешающая способность большинства серийных электронных микроскопов составляет 5 А. Это значит, что с их помощью можно дифференцировать две структуры шириной 5 находящиеся на расстоянии 5Я, тогда как при меньшем расстоянии они становятся неразличимыми и сливаются в одно целое. Теоретически возможны электронные микроскопы с большей разрешающей способностью, и в настоящее время существуют приборы, позволяющие дифференцировать структуры, разделенные всего лишь 2 А. Достаточно ли такого разрешения для идентификации оснований в полинуклеотидной цепи, можно видеть из рис. 9.1. На этом рисунке показан участок нуклеиновой кислоты в развернутой конформации, так что расстояние между основаниями близко к максимальному и составляет 7 А. Размер пуриновых оснований вдоль короткой и длинной осей составляет соответственно 2,5 и 5,5 Я, а размер пиримидиновых оснований - 2 и 4 Я, Таким образом, разрешающая способность серийных микроскопов достаточно близка к той, что требуется для структурного анализа. [c.201]

Этот И все другие методы идентификации одного или нескольких нуклеотидов из общего числа 3000—200 ООО (число нуклеотидов, составляющих молекулу вирусной нуклеиновой кислоты) требуют огромных количеств дорогостоящего материала. Но задачу можно значительно облегчить, если использовать метод введения радиоактивной метки в нуклеиновые кислоты или в модифицирующие их соединения. Например, выдерживая инфицированные растения в атмосфере можно получить вирусы растений и их РНК с удельной радиоактивностью 1000—5000 имп/мин на 1 мг. А при наличии такого образца можно обнаружить и идентифицировать концевое основание, имея всего лишь около 1 мг вирусной РНК. [c.98]

Выделение и идентификацию компонентов нуклеиновых кислот производят с помощью физико-химических методов. Очень важную роль в разделении сложных смесей играют хроматографические методы ( см. 15.1). Пиримидииовые и пуриновые основания, обладающие заметным поглощением около 260 нм, обычно идентифицируют с помощью УФ-спектроскопии (см. 15.3.1). Поскольку нуклеотиды имеют кислотный характер и способны находиться в ионизированном сосюя НИИ, то для идентификации их используют также электрофорез (см. 15.1). [c.444]

Идентификация модифицированных нуклеотидных остатков в полинуклеотидной цепи РНК долгое время была задачей особой трудности. С появлением современных методов секвенирования нуклеиновых кислот она существенно упростилась. Модификацию РНК или ее расщепление ферментами ведут таким образом, чтобы (как и при секвенировании) было затронуто в среднем только одно звено на молекулу (в чем есть дополнительный смысл, так как множественная модификация РНК искажает ее структуру). Далее, если изучается РНК небольшого размера или сегмент РНК, примыкающий к одному из ее концов, то этот конец метят радиоактивной меткой и задача идентификации модифицированного основания (после расщепления соответствующего звена) или атакованной нуклеазой межнуклеотидной связи сводится, как и при секвенировании, к определению длины фрагмента по его подвижности в высокоразрешающем электрофорезе в геле. В том случае, когда анализируемый район удален от концов молекулы на расстояние больше 150—200 н. о., используют реакцию обратной транскрипции (см. гл. 13). Для этого синтезируют олигонуклеотид, комплементарный участку РНК, расположенному вблизи от анализируемого района с З -концевой стороны молекулы, и далее используют его как праймер для обратной траискриптазы. Так как этот фермент останавливается на модифицйрованных остатках матрицы (или в том месте, где расщеплена фосфодиэфирная связь), то вновь по длине образующегося фрагмента можно определить положение модифицированного звена в РНК. [c.40]

Идентификация углеводных компонентов также проводится после кислотного гидролиза нуклеиновых кислот. При этом из пуриновых или предварительно гидрированных по 5, 6-двойной связи пиримидиновых рибонуклеотидов образуется О-рибоза. Основания дезоксирибонуклеотидов отщепляются в значительно более мягких условиях, чем рибонуклеотиды, но вследствие нестабильности образующаяся дезоксирибоза превращается в левулиновую кислоту. При чрезвычайно мягкой обработке кислотой пуриновых или восстановленных пиримидиновых дезоксирибонуклеотидов удается выделить дезоксирнбозу или ее легко идентифицируемые производные [c.306]

При разделении защищенных нуклеозидов, например ано-мерных рибофуранозилпроизводных урацила, в качестве сорбента с успехом используют нейтральную окись алюминия, а в качестве элюента — смеси бензола и этилацетата в разных пропорциях [44, 45, 84, 85]. В табл. 37.6 приведены значения Ка основных нуклеозидов на колонке с сефадексом на основании этих данных можно оценить возможность разделения той или иной смеси методом гель-проникающей хроматографии при использовании элюентов различного состава [47, 48, 67—69]. Хорошие результаты дает разделение на обычных или специально фракционированных биогеле Р-2 [86, 87] и сефадексе 0-10 [88]. Показано, что эти два геля можно использовать для определения нуклеотидного состава нуклеиновых кислот (рис. 37.11). Биогель Р-2 применяют также для разделения нуклеозидов в присутствии большего количества нуклеотидов, которые в этом случае элюируются существенно быстрее, чем на сефадексе 0-10. Хроматографию на биогеле Р-2 или сефадексе 0-10 неоднократно использовали в качестве микроаналитического метода при определении нуклеозидного состава энзиматических гидролизатов ДНК [89—91] и идентификации концевых нуклеотидов [92]. Смесь рибо- и дезоксирибонуклеозидов разделяли на колонке с фракционированным биогелем Р-2 в буферном растворе (pH 10,1), содержащем тетраборат натрия (рис. 37.12) [87]. Для отделения тимидина от 5-бром- и 5-иоддезоксиуридинов предложено проводить хроматографию на сефадексе 0-10 в фос-фатноцитратном буферном растворе с pH 3,5 [93, 94]. [c.53]

Методы, собранные в этих двух книгах, весьма разнообразны и охватывают почти все стороны исследований этой важнейшей грунны соединений. Здесь можно найти методы выделения и анализа отдельных компонентов нуклеиновых кислот (пуриновых и пиримидиновых оснований, нуклеозидов и нуклеотидов), методы выделения, разделения и анализа олигонуклеотидов, изолирования отдельных клеточных органелл, выделения и фракционирования нуклеиновых кислот (ДНК и РНК), а также изолирования их суммарной фракции для различного рода исследований, способы идентификации нуклеиновых кислот, методу. модификации их молекул, методы изучения их синтеза как in vivo, так и in vitro, методы изучения нуклеиновых кислот в связи с процессом биосинтеза белка и, наконец, методы изучения биологических свойств нуклеи1говых кислот, в том числе их иммунологических свойств. [c.5]

Основания, в особенности пуриновые, по своей природе гидрофобны, и лишь присутствие рибозы и ионизированных фосфатов делает нуклеиновую кислоту пщро-фильпой и водорастворимой. Величина р/(С диалкилфос-фатной группы равна примерно единице т. е. фосфаты РНК и ДНК полностью ионизированы, исключая концевые фосфаты, которые содержат лишнюю ионизирующуюся группу и имеют вторичную константу диссоциации с величиной pi d около 6. Это свойство концевых фосфорилиро-вапных нуклеотидов нейтрализовать один из своих зарядов между pH 7 и 5 используют для их идентификации. [c.95]

Наиболее широко распространенный метод определения и идентификации дезоксирибозы и рибозы нуклеиновых кислот (ДНК и РНК) в клеточных экстрактах включает экстракцию и гидролиз горячим раствором ТХУ или хлорной кислоты и последуюшее проведение специальных колориметрических анализов для определения пентозных компонентов нуклеиновых кислот. Более удобный способ определения количества ДНК и РНК основан на их способности поглощать УФ-свет при 260 нм. Другие методики, меньше отвечающие целям данного руководства, описаны в рекомендуемых изданиях [59, 63]. [c.334]

На рис. 22.10 приведена структурная формула АрА. В соответствии с изложенными в гл. 6 представлениями о конформациях нуклеиновых кислот, оба основания изображены с углами поворота, соответствующими онлпы-конформации. Легко видеть, что протон Н-8 в рА расположен ближе к фосфатной группе, чем этот же протон в Ар. Поэтому линия от этого протона в рА будет испытывать большее уширение под влиянием ионов Мп , что и позволяет провести идентификацию. Напротив, протон Н-Г в рА расположен дальше от фосфатной группы, так что уширение для него будет меньше, чем в случае Н-Г в Ар. К сожалению, два протона Н-2 расположены далеко от фосфатной группы и приблизительно эквидистантно, так что связывание Мп не помогает их идентификации. В этом случае приходится использовать менее прямые данные. Во многих случаях лучшее, что- [c.256]

Возможность помещения прибора, аналогичного рассмотренному выше, на элект-эофоретический гель с целью идентификации белка или нуклеиновой кислоты сама по жбе представляется достаточным основанием для дальнейшей разработки этого 1ринципа. [c.367]

Отношения оснований лишь весьма приблизительно отражают истинные последовательности осиоваиий в молекуле нуклеиновой кислоты. Тем не меиее эти отношения иногда могут служить для идентификации тех или иных групп вирусов. Например, для ВЖМТ и вирусов, сходных с ВЖМТ по ряду других признаков, характерно необычно высокое содержание цитидиловой кислоты. [c.480]

Адансоп [6] считал, что систематические единицы следует выделять, учитывая все известные признаки и считая их равнозначными. Он предложил несколько не связанных между собой классификаций, основанных каждая иа каком-то одном признаке, а затем сравнил результаты, полученные при идентификации видов, произведенной на основании разных признаков. В конечном счете были получены группы, основанные на наибольшем числе совпадающих признаков. Этот метод слишком трудоемок и до недавнего времени не получил широкого распространения, так как для получения удовлетворительных результатов требовалось учесть не менее 60 равнозначных независимых качественных (т. о. 4- или —) признаков [1635]. Однако с появлением вычислительной техники возродился интерес к классификациям такого рода. Вычислительную машину можно по-разному использовать для экспериментальной разработки классификации вирусов [145, 146, 616]. Анализ, проводимый при помощи такой машипы, объехстивен, причем могут учитываться числовые данные, такие, как отношение оснований в нуклеиновых кислотах и аминокислотный состав белка. Классификацию, основанную на расчетах, получеппых с помощью вычислительной машины, иа данном этапе следует рассматривать как экспериментальную. Этот подход, как и любой другой метод классификации, также лимитирован недостатком данных о вирусах. На практике неизбежно некоторое взвешивание признаков, даже когда оно сводится к решению вопроса о том, какие признаки отбросить, а какие включить. Из всех возмоншостей этого подхода нас в настоящее время в основном будет интересовать проверка систем классификаций, полученных другими методами, и выявление новых, ие известных ранее отношений между вирусами, существование хадторых меняет быть затем проверено экспериментальным путем. [c.486]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология