Полипептиды, анализ на концевые группы

Важнейшим этапом в выяснении структуры полипептидов и белков является определение последовательности аминокислот. Не считая применения масс-спектрометрии для решения этой проблемы [14] (см. кн. I гл. 5), основным методом определения последовательности аминокислот является анализ концевых групп он состоит в определении аминных и карбоксильных концевых групп. Для решения этой задачи были разработаны различные химические и ферментативные методы. [c.402]

Применение частичного и полного гидролиза, метода анализа концевых групп и идентификации пептидных фрагментов для выяснения структуры полипептидов и даже белков низкого молекулярного веса лучше всего проиллюстрировать на некоторых примерах. Поскольку эти примеры включают антибиотики, гормоны, токсины и ферменты, рассмотрим каждую группу в отдельности. [c.407]

Ввиду того, что различия в растворимостях полипептидов очень невелики, для выделения индивидуальных пептидов и.з смесей требуются специальные методы. К ним относятся фракционный диализ, распределительная хроматография (например, на колонке из бумажного порошка или листе бумаги), адсорбционная хроматография, ионнообменная хроматография, электрофорез и противоточное распределение по Крэйгу (т. е. распределение между двумя ограниченно смешивающимися жидкостями). Для характеристики выделенных пептидов и доказательства их однородности применяют противоточное распределение, количественный анализ аминокислотного состава и определение концевых групп полипептидной цепи. [c.383]

Наиболее успешным методом определения С-концевых остатков является не химический метод, а ферментативный. Селективное удаление С-концевого звена осуществляется при помощи фермента карбоксипептидазы (из поджелудочной железы), которая расщепляет лишь ту пептидную связь,которая расположена в а-положении к свободной а-карбоксильной группе в полипептид-ной цепи. Анализ можно повторить на укороченном пептиде с тем, чтобы идентифицировать новый С-концевой остаток и т. д. [c.1049]

Олькотта 41 а], полностью этерифицирует целый ряд белков [416]. Подобным же образом, окиси, за исключением эпихлоргидрина, не вступают в -реакцию с карбоксильными труппами шерсти - давление, -не наблюдавшееся в случае других белков [42]. Бейли (43] отметил, что такие способы экранирования, как метод ДНФ-производных, применялись преимущественно к растворимым корпускулярным белкам. Он распространил этот метод на растворимые асимметрические белки — тропомиоаин, миозин и фибриноген — и провел сравнительное физико-химическое исследование указанных белков. Было найдено, что в миозине реагируют все боковые цепи лизина, а в тропомиозине — только около 85% их. Неожиданно оказалось, что эти белки представляют собой, ловвдимому, циклические полипептиды, так -как в их молекулах не было обнаружено свободных концевых аминогрупп. Подобное же наблюдение было сделано ранее для яичного альбумина, однако оно может быть объяснено наличием связи с прсстетической углеводной группой [36]. Эти интересные результаты следует еще раз проверить с помощью анализа концевых групп, особенно карбоксильных. [c.277]

В своей первой работе Лейхс II] сообщал, что при добавлении не больших количеств воды к ЫКА глицина из системы выделяется дву окись углерода и образуется смола. Это наблюдение было обобщено им и другими авторами, и полимеризацию ЫКА во влажных растворителях рассматривали некоторое время как хороший метод получения полипептидов. К 1947 г. Вудворд и Шрамм [28] сообщили о полимеризации ЫКА Ь-лейцина и 0,Ь-фенилаланина во влажном бензоле, и в этом процессе, по общему мнению, образовались полипептиды с молекулярным весом больше 1 ООО ООО. К сожалению, этот результат оказался ошибочным. Молекулярный вес образовавшегося сополимера определяли осмометрически в бензоле, а в этом растворителе существует интенсивная агломерация исследуемых полиаминокислот. Анализ концевых групп, проведенный Колеманом и Фартингом [29], а также другими авторами [30], показал, что степень полимеризации в этом случае не превышает 100. [c.553]

Кроме того, определением концевых групп (амино- и карбоксильных) по способу Зангера [25], Фромажо [26] и Чибнэлла и Риса [27] устанавливается максимальное число открытых пептидных цепей,. входящих в состав молекулы белка. Этот метод анализа в настоящее время ие может привести к однозначным результатам в связи с известными (а также возможными) случаями наличия циклических пептидных цепей в большом числе полипептидов и белков (грамицидин [28], яичный альбумин [29], тропомиозин и миозин [30]). [c.212]

За последнее десятилетие были достигнуты значительные успехи в дальнейшем установлении точного строения различных белков. Хотя гидролиз белков и последующий анализ гидролизата, который широко использовался раньше, давал возможность получать данные об относительном содержании и природе входящих в состав белка аминокислот, он не позволял сделать какие-либо выводы о распределении аминокислот в полипептидной цепи молекулы белка. Методы анализа и разделения аминокислот до сороковых годов были очень длительными и трудоемкими н требовали сравнительно больших количеств исходного продукта. Разработанные в 40-х годах новые методы анализа и разделения аминокислот и определения концевых групп в молекулах белков и не слишком высокомолекулярных полипептидов создали возможность наметить основные направления решения исключительно важной проблемы выяснения специфической последовательности аминокислот в молекулах некоторых сравнительно простых белков. Первым большим достижением в этой области химии была расшифровка Сангера с сотр. [4] последовательности аминокислот в молекуле инсулина. С момента опубликования этой важнейшей работы, достигшей цели, которая в течение длительного времени казалась неосуществимой, была полностью выяснена последовательность аминокислот у нескольких белков. Установление того факта, что молекулы специфического белка являются однородными по молекулярному весу и содержат строго определенную последовательность аминокислотных звеньев, неизменную для всех макромолекул, явилось одним из наиболее важных достижений химии белка. В число белков, для которых была выяснена последовательность аминокислот, входят инсулин [4], цитохром С [5—7 , белок вируса табачной мозаики [8—10], рибонуклеаза [11 — 13], а- и Р-цепи гемоглобина человека [14, 15], миоглобин кита [16—18], кортикотропин [19—21], глюкагон [22] кроме того, была установлена последовательность аминокислот в некоторых полипептидах более низкого молекулярного веса и частично выяснена последовательность аминокислот у нескольких высокомолекулярных белков [23]. [c.329]

Цитоплазма, окружающая органеллы нервных клеток, состоит главным образом из воды, белков и неорганических солей (рис. 6.1). К белкам относятся как структурные макромолекулы и высокомолекулярные ферменты, так и более низкомолекулярные вещества типа полипептидов, пептидов и различных аминокислот. Концевые группы многих подобных молекул диссоциируют в водной среде цитоплазмы, и благодаря этому молекулы приобретают электрический заряд, т. е. превращаются в ионы. Содержание этих органических ионов в гигантском аксоне кальмара можно определить путем простого выдавливания цитоплазмы с ее последующим анализом. Подобный анализ показал, что главным органическим ионом нервных клеток является изетионат. Поскольку суммарный заряд этого иона отрицателен, он представляет собой органический анион (А ). Полагают, что в других типах нервных клеток содержатся глутамат, аспартат и органические фосфаты. Все подобные молекулы несут отрицательный суммарный заряд, т. е. являются анионами. [c.129]

Расщепление полипептидной цепи на фрагменты проводят обычно при помощи протеолитических ферментов, таких, как трипсин, химотрипсин или пепсин. Эти ферменты действуют на различные участки полипептидной цепи, так как имеют повышенное сродство к различным аминокислотным остаткам. Необходимо учитывать также соседние аминокислотные остатки, т. е. пространственное окружение атакуемой пептидной связи. Оказалось, что трипсин гидролизует только те пептидные связи, в образовании которых участвует карбоксильная группа лизина или аргинина, а химотрипсин гидролизует связи по фенилаланину, триптофану и тирозину Обычно протеолитические ферменты, гидролизующие полипептидные цепи, предварительно иммобилизуют на нерастворимых матрицах для более легкого отделения их от продуктов гидролиза. Далее определяют аминокислотные последовательности каждого полипептидного фрагмента. Для этого чаще всего используют метод Эдмана, заключающийся в анализе полипептида только с Ж-конца. Концевая аминокислота при взаимодействии с фенилизотиоцианатом в щелочной среде образует стойкое соединение, которое можно отщепить от полипептида без его деградации. Фенилтиогидантоиновое (ФТГ) производное аминокислоты идентифицируется хроматографическим методом. После идентификации концевого Ж-амино-кислотного остатка метка вводится в следующий аминокислотный остаток, [c.41]

Определение аминогрупп. Концевые аминогруппы содержат белки и синтетические полимеры полипептиды, полиамиды, по-лигидразиды, полиуретаны, полимочевины, политриазолы и др. Аминогруппы в этих полимерах можно определять титрованием кислотами или ацетилированием. Метод титрования получил более хнирокое распространение, так как не все высокомолекулярные соединения, содержащие аминогруппы на концах цепи, могут быть ацетилированы из-за их плохой растворимости в пиридине или других применяемых для этой цели растворителях. С другой стороны, определению аминогруппы методом ацетилирования мешает наличие гидроксильных групп в полимерах. Для такого широкого круга полимеров с концевыми аминогруппами, естественно, трудно подобрать универсальную методику количественного анализа, поэтому остановимся лишь на примерах определения аминогрупп в полиамидах. [c.116]