Криопротекторы

Наиболее известны такие криопротекторы, как диметилсуль-фоксид (ДМСО), различные сахара, глицерин, этиленгликоль и их производные. Действие криопротекторов состоит в снижении количества свободной воды, повышении вязкости раствора. Все криопротекторы делят на две группы проникающие и непроникающие. Это разделение достаточно условно. Так, глицерин — первое вещество, определенное как криопротектор, может проникать в клетку, если его добавлять при комнатной температуре, или выступать как непроникающее соединение, если его добавлять при температуре О °С. Принято считать, что непроникающие криопротекторы специфически влияют на мембрану, повышая ее проницаемость. Применение сильных, проникающих в клетку криопротекторов ограничено их токсичностью. Поэтому обычно используют смеси криопротекторов, так как в них токсичность одного из веществ снижается за счет присутствия другого. [c.201]

О сущности этого метода, в том числе — об использовании криопротекторов см. главу 10. [c.598]

Температура - один из самых мощных факторов воздействия на химические реакции. Как правило, скорость большинства реакций экспоненциально возрастает с повыщением температуры. Между тем уже найдены реакции, скорость которых, наоборот, увеличивается при понижении температуры [1—3]. Для ряда процессов установлено, что перевод системы в режим низких температур коренным образом меняет механизм реакции. Для консервации и длительного хранения биологических объектов и живых организмов приходится применять так называемые криопротекторы, в качестве которых выступают неводные растворители одноатомные и [c.156]

Для успешного решения проблемы низкотемпературной консервации биологических объектов необходимо разобраться в механизме биохимических процессов, происходящих при пониженных температурах. В ходе исследований было обнаружено, что живые организмы способны адаптироваться к низким температурам, синтезируя повышенные количества криопротекторов, роль которых [c.232]

Введение криопротекторов предотвращает ряд нежелательных процессов, влияет на протекание биохимических процессов и, в частности, на активность ферментов. [c.233]

Природа позаботилась о том, чтобы криопротекторы, образующиеся в живых организмах, адаптирующихся к действию низких температур, не были токсичны и выводились затем из организма. При использовании искусственных криопротекторов для низкотемпературной консервации об этом должен заботиться исследователь. [c.233]

Присутствие органических соединений влияет на активность ферментативных процессов при нормальных и пониженных температурах [614]. Необходимо, чтобы при охлаждении активность ферментов менялась обратимо и при хранении аде происходило денатурации ферментов. Например, применение в качестве криопротекторов Сахаров предотвращает денатурацию некоторых ферментов. Для решения этих и других задач важно исследовать активность ферментов в жидких и замороженных растворах при пониженных температурах. [c.233]

Таким образом, медленное замораживание и использование криопротекторов позволяет освободить клетку от свободной воды, и при — 40 С клетки становятся полностью обезвоженными, что дает возможность проводить дальнейшее замораживание, а именно погружать ампулы с растительным материалом в жидкий азот. [c.138]

В клеточной биологии особенно успешно используются два метода, основанные на получении механических реплик. Один из них - метод электронной микроскопии замораживание-скалывание - дает возможность изучать внутреннее строение клеточных мембран. Клетки замораживают при температуре жидкого азота (-196°С) в присутствии криопротектора (антифриза) во избежание искажений за счет образования кристаллов льда. Замороженный блок затем раскалывают [c.186]

Для подготовки клеток к лиофилизации их суспендируют в среде, содержащей криопротекторы. Американская Коллекция типовых культур достигла успеха в длительном хранении физиологически различных бактерий, применяя в качестве криопротекторов либо 20%-ное снятое молоко (при использовании двойных ампул), либо 24%-ный раствор сахарозы, разведенный равным объемом ростовой среды (конечная концентрация сахарозы 12% при использовании одинарных ампул). В других лабораториях в качестве криопротекторов используют декстран (10%), лошадиную сыворотку, инозит и др. [8, 14, 20]. [c.521]

При хранении бактерий в жидком азоте применяют криопротекторы двух типов. К первому относятся глицерин и диметилсульфоксид (ДМС), которые легко проходят через клеточную мембрану и обеспечивают как внутриклеточную, так и внеклеточную защиту от замораживания. Ко второму виду криопротекторов относятся такие вещества, как сахароза, лактоза, глюкоза, маннит, сорбит, декстран, поливинилпирролидон и полигликоль, которые обеспечивают защитное действие на наружной поверхности клеточной мембраны. Протекторы первого типа, т. е. глицерин и ДМС, оказались более эффективными и пригодными для широкого круга бактерий. Выбор криопротектора зависит от вида бактерий. При замораживании новых штаммов следует предварительно проверить действие на них криопротектора. [c.527]

Сохранение жизнеспособности микроорганизмов при замораживании и оттаивании зависит от природы организмов, возраста и плотности популяции, условий культивирования, криопротекторов, скорости замораживания — оттаивания и других факторов. [c.151]

Обычно наиболее значительной по объему составной частью криозащитной среды является водный раствор так называемого криопротектора, который в жидком состоянии смешивается с растворителем в произвольных отношениях, но полностью вытесняется кристаллами льда в жидкие межкристаллические каналы при фазовом переходе. В настоящее время в качестве крио-протекторных веществ чаще других применяют глицерин и ди-метилсульфоксид. Кроме криопротектора и воды криозащитные среды, как правило, содержат в сравнительно небольших коли- [c.8]

На рис. 2 и 3 приведены диаграммы плавления смесей глицерина и диметилсульфоксида с водой, т. е. графически изображена зависимость температуры плавления этих смесей от концентрации криопротектора в растворе. Точка О представляет собой точку плавления чистого льда. Как видно из диаграмм плавления, увеличение исходной концентрации глицерина (ди- [c.9]

На рис. 3 изображен процесс затвердевания (при медленном охлаждении) двухкомпонентного раствора, исходный состав которого соответствует концентрации Со (рис. 3). Когда по мере охлаждения температура указанного раствора снизится до значения То, в нем (если время выдерживания раствора при этой температуре достаточно велико) возникнут кристаллы льда. В процессе дальнейшего охлаждения количество льда будет увеличиваться, а концентрация криопротектора (и других растворенных в небольших количествах веществ) в жидкой фазе, сосуществующей с кристаллами, — повышаться. Следовательно, точка, соответствующая жидкофазному состоянию, будет перемещаться вдоль кривой плавления а—В. При температуре Тв [c.9]

Сущность метода криосохранения сводится к замораживанию специально подготовленных растительных клеток при использовании криопротекторов — веществ, ослабляющих повреждения клеток при замораживании и оттаивании. В настоящее время известны два метода криосохранения программное (медленное) и сверхбыстрое замораживание. Программное замораживание изучалось уже давно, поэтому оно довольно широко применяется для сохранения животных и растительных клеток. Разработка сверхбыстрого замораживания началась сравнительно недавно, однако считается, что именно этот метод со временем станет наиболее перспективным. [c.200]

Избежать кристаллизации льда помогла бы витрификация воды, т. е. затвердение ее в аморфном состоянии. Получить витрифика-цию чистой воды практически невозможно. Но в коллоидных растворах скорость образования центров кристаллизации и роста кристаллов льда снижается и повышается температура, при которой их рост прекращается. Все это облегчает витрификацию. Добавление криопротекторов также затрудняет кристаллизацию льда и способствует витрификации. [c.201]

Таким образом, криосохранение достаточно надежно обеспечивает сохранение генофонда. Перспективность этого метода подтверждается возобновлением после хранения в жидком азоте суспензионных культур моркови, явора, кукурузы, риса, сахарного тростника каллусных — тополя, маршанции, сахарного тростника андрогенных эмбриоидов — беладонны, табака и др. Из восстановленных после замораживания культур моркови и табака удалось регенерировать целые растения. После быстрого замораживания сохранили жизнеспособность меристемы земляники, малины, гвоздики, томатов, картофеля и ряда других растений. Однако для криосохранения требуется сложная работа по подбору условий, обеспечиваюш их выживание клеток и, следовательно, возможность последующей регенерации из них целых растений. Необходимо учитывать генетические и морфофизиологические особенности клеток, способность к закаливанию, уровень проницаемости клеточных мембран, подбор криопротекторов, скорость снижения температуры при замораживании, условия оттаивания. [c.202]

Чтобы уменьшить образование внутриклеточного льда в процессе охлаждения клеток, используют криопротекторы (в концентрации около 2 М) с разным механизмом действия. Они снижают точки замерзания (точку плавления) и переохлаждения воды (температзфа, при которОй происходит гомогенная кристаллизация льда), поднимают точку девитрификации раствора (тем-ператзфа, при которой происходит исключение аморфности, стек-ловидности и когда начинается внезапная кристаллизация). Раствор остается аморфным, когда он охлаждается быстро, то есть время, необходимое для роста кристаллов, ограничено. В этом случае говорят, что растврр витрифицируется. При медленном нагревании такого раствора происходит выделение тепла, совпадающее по времени и внезапной кристаллизацией или девитрификацией. [c.529]

К числу криопротекторов относят глицерин, гликаны, гликопротеины, ДМСО, сахарозу, ПВС, сыворотку крови и др. Их можно использовать по отдельности или в смесях. Лучший способ стерилизации растворов криопротекторов — мембранная фильтрация. [c.529]

Установлено, что при криосохранении протопластов из многих видов растений достигают 70—90%-й их выживаемости. При сочетании медленного и ступенчатого замораживания и быстрого оттаивания в качестве криопротектора рекомендуют 10% ДМСО. [c.529]

Для криосохранения каллусов обычно применяют двух- или трехкомпонентную смесь криопротекторов 8% глюкоза, 10% ДМСО и 10% ПЭГ (ММ 6 кДа). [c.529]

Для суспензионных культур клеток нербдко рекомендуют трехкомпонентную двухмолярную смесь криопротекторов, включающую глицерин (0,5 М), ДМСО (0,5 М) и сахарозу (1 М). [c.531]

Низкие температуры давно используют для снижения скоростей реакций и для консервации и длительного хранения пищевых продуктов. Интерес к длительному хранению простых и сложных биологических объектов и живых организмов в последние годы значительно возрос и вызван, в первую очередь, требованиями медицинской практики, возникшими в связи с развитием методов гипотермии и криотермии. В настоящее время уже создаются международные учреждения по хранению органов и биологических препаратов, необходимых, в частности, в операциях по трансплантации. Решение этой задачи, естественно, не обходится без трудностей. Так, для длительной консервации (на месяцы и годы) необходимо полное замораживание и охлаждение до температур жидкого азота, а температуры, создаваемые в рефрижераторах и морозильных установках, недостаточно низки. Кроме того, при замораживании даже относительно простых биологических объектов часто происходит их гибель. Основная причина гибели связана с физическими повреждениями клеток в результате образования кристаллов льда и с химическими реакциями, вызванными концентрационными и температурными изменениями. Эти трудности удается обойти, применяя криопротекторы, такие как глицерин, эти-ленгликоль или диметилсульфоксид. С помощью криопротекторов осуществлена длительная обратимая консервация таких биологических объектов, как белые кровяные тельца, сперма, костный мозг, хрящи. Разрабатываются методы обратимой консервации более сложных биологических систем и даже целых органов. [c.232]

Скорость замораживания и присутствие криофилактиков оказывает влияние на выживаемость костной ткани и на процессы дифференциации и деления клеток [733]. Охлаждение организма животных позволяет продлить состояние клинической смерти [734], что очень важно для успешной реанимации. Используя в качестве криопротекторов диметилсульфоксид и бычий альбумин из плазмы, удалась разработать методику хранения митохондрий из печени р-ысы в замороженных при температуре жидкого азота растворах < [735]. Митохондрии выполняют роль энергетических фабрик в клетке и представляют собой сложные биологические объекты. Осуществление длительной консервации митохондрий без нарушения их последующего функционирования является большим достижением. [c.268]

Процессы стеклования криогранул следует рассматривать и как положительное явление, если их подвергать криоэкстрагированию или крио-осаждению. С этой позиции процессы стеклообразования при замораживании растворов являются желательными для их интенсификации используют криопротекторы — вещества, увеличивающие вязкость растюров и способствующие их переходу при быстром замораживании в стеклообразное состояние. К криопротекторам относятся, например, органические вещества, модифицирующие структуру исходного раствора и изменяющие механизм льдообразования. Наиболее распространенными криопротекгорами являются глицерин, спирты (метанол, этанол и др.), полиэтиленоксиды, гликоли и т.д. [c.106]

Несмотря на многообразие работ в этом направлении, в них все же наметились общие приемы, лежащие в основе криосохранения обработка клеток перед замораживанием, применение криопротекторов, соблюдение определенного режима замораживания в интервале от О до — 40°С (в редких случаях до — 70"С), а также специальные предосторожности при оттаивании объектов. [c.137]

Подбор криопротекторов, веществ, уменьшающих повреждение клеток от осмотического и механического стресса, проводят эмпирически по принципу наименьшей токсичности и оптимального эффекта. Среди всех известных криопротекторов выделяются такие легко проникающие в клетки вещества, как диметилсульфоксид (ДМСО, 5—10%), глицерин (10—20 %), а также непроникающие высокомолекулярные — поливи-нилпиролидон (ПВП), декстран, полиэтиленгликоль (ПЭГ) с молекулярной массой 6000. [c.137]

В последние годы установлено, что замороженные и оттаявшие эмбрионы могут быть успешно разбавлены одноступенчато в пайете, где они были заморожены. Сущность метода состоит в следующем. Заморожен но-оттаянные эмбрионы переносят одноступенчато из раствора криопротектора, в частности 1,5 М глицерина в фосфатном буфере, в котором они были заморожены, в среду, содержащую гипертонический раствор не проникающего в клетку соединения, каким является сахароза. Это обеспечивает постепенное удаление криопротектора из эмбриона без нарушения осмотического равновесия в 0,02 мл 1,5 М глицерина. [c.207]

Успешное замораживание и оттаивание эмбрионов овец впервые было проведено С. Вилладсен и др. (1974). Эмбрионы медленно охлаждали (от 0,3 до 2,0°С/мин) и медленно оттаивали (от 4 до 25 С/ мин). В качестве криопротектора применяли ДМСО. Позднее установлено, что при [c.207]

Для изучения природы релаксационных процессов в высокоупорядоченном комплексе переносчиков используются различные воздействия, модифицирующие систему водородных связей в РЦ изотопное замещение Н2О на D2O, модификация водородных связей в образцах криопротекторами, многоатомными спиртами (этиленгликоль, пропиленгликоль), апротонными растворителями (диметилсуль-фоксид). Эти воздействия, делая водородные связи менее лабильными, замедляют релаксационные процессы, уменьшают подвижность и увеличивают жесткость макромолекул. Как оказалось, они замедляют в 2-2,5 раза перенос электрона в РЦ. На рис. XXVIII.2 представлены изменения поглощения при 665 нм, соответствующие появлению и исчезновению восстановленного бактериофеофитина под влиянием изотопного замещения D2O на Н2О и действия диметилсульфоксида. Видно, что указанная модификация системы водородных связей приводит к замедлению переноса электрона на этапах Р Бфф и Бфф Qa- Степень эффекта, вызванного действием криопротектора, увеличивается в зависимости от его гидрофобности и коррелирует с глубиной его проникновения во внутренние области фотосинтетических мембран. Одновременно с замедлением прямого переноса Р Бфф появляется компонента восстановления Р в ходе рекомбинации Р+ <— Бфф (рис. XXVIII.2, в, кривая 2) со временем О, 7-1 не, что сопровождается возникновением замедленной люминесценции с тем же характерным временем. [c.363]

Клетки выращивают в соответствующей среде. В случае жидких культур клетки отделяют в стерильных условиях центрифугированием и ресуспендируют осадок в стерильной свежей среде, содержащей или 10% (объем/ объем) глицерина (готовят добавлением 20%-ного глицерина к равному объему стерильной среды), или 5% (объем/объем) ДМС (приготовленного добавлением соответствующего количества 1007о-ного ДМС к стерильной среде). В случае роста культур на агаре клетки смывают с его поверхности стерильной жидкой средой, содержащей подходящий криопротектор, и разливают в стерильные маркированные ампулы по 0,4 мл суспензии, содержащей не менее 10 клеток/мл. [c.528]

Давно замечено, что микроорганизмы, замороженные в солевом растворе или в бульоне, быстро погибают вода — умеренно детальна, а глицерин и молоко обладают защитным действием. После установления протективных свойств глицерина многие соединения испытывали для защиты микроорганизмов от повреждающего действия низких температур. В качестве криопротекторов применяются как низкомолекуляриые вещества (10—20%-ный глицерин, 7—10%-ыый диметилсульфоксид, 10—20%-ная сахароза), так и высокомолекулярные (белки, 10%-иый поли-винилпирролидон). Условно их подразделяют на две группы 1) вещества, проникающие в клетки (глицерин, диметилсульфоксид) 2) вещества, не проникающие в клетки (например, поливинилнирролидон). [c.152]

Механизм криозащитиого действия этих веществ окончательно не выяснен. Предполагается, что криопротекторы уменьшают концентрацию электролитов, противодействуют осмотическому давлению, изменяют структуру воды вне клеток, действуют иа поверхность и проницаемость клеток. [c.152]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология