Точки начала плазмиды

Рис. 9-57. Метод выявления автономно реплицирующихся последовательностей (ARS-элементов) у дрожжей Эти последовательности выступают в роли точек начала репликации, содержащие их плазмиды способны самостоятельно реплицироваться в хозяйской клетке, не включаясь в состав хромосом.

Бинарный вектор. Другой, более простой и поэтому более часто применяемый метод введения чужеродной ДНК заключается в использовании бинарных векторов. Как уже упоминалось, для заражения и трансформации растительных клеток агробактериям необходима vir-o6-ласть, ответственная за перенос ДНК, и прямые повторы, ограничивающие район Т-ДНК. Более того, угУ-область и пограничные повторы Т-ДНК не обязательно должны находиться в одной плазмиде. Система бинарных векторов основана на том, что в агробактериальной клетке, используемой для трасформации растений, одновременно находятся две плазмиды. Одна содержит область пограничных повторов Т-ДНК, а другая — v/r-область. Обе плазмиды могут независимо реплицироваться в клетках агробактерии, однако, поодиночке не могут приводить к трансформации растений. При этом плазмида, несущая Т-ДНК, содержит в своем составе фрагменты плазмиды Е. соИ (в том числе и точку начала репликации), что позволяет проводить все манипуляции по клонированию в клетках Е. соИ и намного упрощает весь процесс. Аналогично коинтегра-тивному вектору нужный ген (целевой) и ген селективного маркера встраиваются в область Т-ДНК, и затем такая рекомбинантная плазмида вводится в клетки агробактерии, которые уже несут другую плазмиду с угг-областью. В отличие от коинтегративных векторов не происходит гомологичной рекомбинации между двумя плазмидами и их объединения в единую векторную молекулу. Белки, экспрессируемые уг>-генами одной плазмиды, вырезают и встраивают в растительный геном области Т-ДНК с чужеродными генами другой плазмиды. В настоящее время такие бинарные векторы наиболее часто используются для трансформации растительных клеток. [c.56]

Эту проблему решали разными путями. Например, сконструировали пакующую клеточную линию, содержащую Е1-область и ряд аденовирусных генов, которые не входят в состав трансдуцирующей ДНК и не попадают в клетки-мишени. Затем удалось добиться того, чтобы ни один из аденовирусных генов не включался в трансдуцирующую ДНК. Для этого линеаризовали плазмиду Е. соН (28 т. п. н.), которая обеспечивает экспрессию одного или большего числа терапевтических генов и не содержит аденовирусных генов, и пришили к ее концам фрагменты ДНК (по 4 т. п. п.), содержащие точку начала репликации аденовирусной ДНК, последовательность, ответственную за ее упаковку, и сигнал терминации. Длина продукта лигирования (36 т. п. н.) соответствует длине полноразмерного генома аденовируса. Затем полученным продуктом и аденовирусным гено- [c.494]

ДНК области начала репликации может быть выделена благодаря ее способности поддерживать репликацию любой последовательности ДНК, к которой она присоединена. Принцип такого подхода состоит в клонировании ДНК из области, несущей точку начала репликации, в такой молекуле ДНК, которая имеет подходящие генетические маркеры, но утратила точку начала. Подобная реконструкция приведет к образованию плазмиды, способной автономно реплицироваться лишь в том случае, если ДНК из области точки начала репликации будет содержать все необходимые для функционирования последовательности. (Такой подход был использован для идентификации центромерной или теломерной ДНК у дрожжей по их влиянию на выживаемость плазмиды гл. 28.) [c.398]

Небольшой белок (63 аминокислотных остатка), кодируемый геном гор, локализован на некотором расстоянии от точки начала репликации по направлению хода репликации. Белок Rop подавляет образование затравки. В настоящее время механизм этого подавления неизвестен, однако вероятно, что в данный процесс вовлекаются последовательности, находящиеся по ходу репликации сразу же за точкой начала инициации затравки. Независимо от характера молекулярного взаимодействия с этими последовательностями, его результатом является уменьшение числа копий плазмиды. [c.407]

A. В области фрагмента длиной 4,5 т. п. н. гибридизация происходит с теми плазмидами, которые ко времени выделения ДНК еще не реплицировались. На то, что большинство плазмидных молекул еще не реплицировалось, указывает интенсивность этого пятна. Низкая частота реплицирующихся плазмидных молекул даже в S-фазе-это один из факторов, которые затрудняют доказательство того, что ARS представляет собой точку начала репликации. [c.395]

У про- и эукариот можно встретить различные вариации на эту тему. Так, каждая из цепей родительской спирали митохондриальной ДНК животных (15 т.п.н.) и ДНК плазмиды ol El (6т.п.н.) имеет свою точку начала репликации (рис. 2.5). Синтез комплементарной цепи некоторых небольщих одноцепочечных фаговых геномов начинается вблизи одной специфической последовательности, а репликация полученного дуплекса может инициироваться совсем в другой точке (рис. 2.6). Репликация линейных дуплексных ДНК также инициируется в особых сайтах. Например, ДНК бактериофага Т7 (40 т.п.н.) реплицируется в двух противоположных направлениях к разным концам молекулы, начиная от одной точки (рис. 2.7), а каждая из двух цепей ДНК аденовируса человека (30-38 т.п.н.) реплицируется последовательно всегда от З -конца (рис. 2.8). [c.68]

Генетические исследования показали, что все Ti-плазмиды имеют сходное строение и содержат последовательности, которые можно поделить на две фуппы 1) необходимые для метаболизма самой агробактерии (гены катаболизма опинов, точка начала репликации плазмиды и т. д.) 2) необходимые для трансформации растительной клетки (см. ниже). При этом следует особо отметить, что гены первой группы имеют прокариотический тип промотора и могут функционировать только в бактериальной клетке, а второй группы — могут работать в растительной [c.51]

Бактериальная хромосома содержит один репликон следовательно, единицы репликации и сегрегации совпадают. Инициация в одной точке начала репликации ведет к репликации всего генома. Наряду с хромосомой бактерии могут содержать плазмиды каждая плазмида представляет собой автономный кольцевой геном и является отдельным репликоном. Некоторые плазмиды разделяют строгость репликации бактериальной хромосомы они представлены в бактериальной клетке в виде одной копии на каждую копию хромосомы (однокопийные плазмиды). Другие плазмиды являются многокопийными, количество их копий в клетке превышает 1. ДНК каждой фаговой или вирусной частицы также составляет репликон, спо- [c.396]

Анализ последовательностей, соответствующих точкам начала репликации, связан с определенными трудностями, поскольку плазмиды, несущие ori , отличаются значительной нестабильностью. Однако в некоторых бактериальных штаммах такие плазмиды способны сохраняться. [c.398]

Плазмиды, несушие в своем составе последовательность ori , сегрегируют неправильно для их стабилизации необходимо введение дополнительных последовательностей. Такой результат позволяет сделать два вывода сама точка начала репликации не несет информации, требуемой для распределения дуплицированных хромосом между дочерними клетками функции, необходимые для правильной сегрегации можно идентифицировать при выявлении последовательностей, которые придают плазмиде сегрегационную стабильность. [c.399]

Любой сегмент ДНК, имеющий точку начала репликации, способен реплицироваться. Отсюда следует, что, хотя плазмиды редко встречаются в клетках эукариот, их можно сконструировать путем соответствующих манипуляций in vitro и ввести в соответствующие реципиентные клетки. (В гл. 38 мы рассмотрим вопрос о судьбе ДНК, введенной в клетки эукариот.) [c.403]

Другая система предоставляет возможность для выделения дискретных точек начала репликации. Клетки дрожжей S. erevisiae, мутантные по какой-то функции, могут быть трансформированы путем добавления ДНК, которая несет копию гена дикого типа. Схема эксперимента представлена на рис. 31.13. Мутация клетки-хозяина должна затрагивать ген, продукт которого можно селектировать. ДНК клеток дикого типа выделяют, фрагментируют и клонируют в составе плазмид Е. oli. Гибридные плазмиды инкубируют с мутантными клетками дрожжей в таких условиях, в которых эти клетки способны выжить только в случае экспрессии гена дикого типа. В зависимости от частоты возникновения трансформированных клеток различают два типа трансформации. [c.403]

Модель негативного контроля плазмидной несовместимости основывается на предположении, что контроль числа копий достигается путем синтеза репрессора, определяющего число точек начала репликации. (Формально она не отличается от модели титрования , предложенной для объяснения регуляции репликации бактериальной хромосомы.) Введение новой точки начала репликации в составе плазмиды той же группы совместимости имитирует результат репликации резидентной плазмиды теперь присутствуют две точки начала репликации. В результате любая дальнейшая репликация предотвращается до тех пор, пока две плазмиды не разойдутся в разные клетки и таким образом не будет восстановлено точное дорепликационное число их копий. [c.406]

Вследствие различия в механизмах экспрессии генов у прокариот и эукариот, Е. oli может оказаться хозяином, мало подходящим для производства белков эукариотических организмов. Поэтому разработаны методы получения векторов для клонирования различных генов в клетках дрожжей - одноклеточных эукариот. Эти клонирующие векторы получают из репликонов дрожжевых клеток, так называемых 2 л-плазмид. Точки начала репликации этих векторов взяты у плазмид 2 л и у pBR322, в результате чего они могут реплицироваться как в дрожжевых клетках, так и в . соИ. Примером использования дрожжей для синтеза белков посредством клонирования генов эукариот может служить осуществленный таким образом синтез интерферона человека (интерферон-белок, обладающий противовирусным действием в клетках человека и, возможно, противоопухолевым действием вообще). [c.290]

Для того, чтобы молекула ДНК могла сформировать активную хромосому, она должна обладать способностью реплицироваться, разделяться при митозе и сохраняться в ряду клеточных поколений. Применение метода рекомбинантных ДНК к клеткам дрожжей позволило вьщелить и определить те элементы, которые превращают последовательность нуклеотидов в хромосому. Два из трех этих элементов были идентифицированы при изучении небольших кольцевых молекул ДНК, самостоятельно реплицирующихся в клетках дрожжей Sa haromy os erevisiae. Оказалось, что для репликации такой молекулы необходима специальная последовательность, которая выполняет роль участка инициации репликации ДНК (называемого также точкой начала репликации). В каждой хромосоме дрожжей таких участков несколько. Второй элемент, необходимый для функционирования последовательности ДНК как хромосомы, называется центромерой. Центромера соединяет содержащую ее молекулу ДНК с митотическим веретеном во время М-фазы (см. разд. 13.5.3). В каждой хромосоме дрожжей имеется только одна центромера. Если участок, выполняющий роль центромеры, встроить в плазмиду, то при делении каждая дочерняя клетка дрожжей обязательно получит одну из двух копий вновь реплицировавшейся молекулы плазмидной ДНК. [c.96]

Конъюгация—это тип опосредуемого клеткой переноса генов, который требует наличия у клетки-донора конъюгативной плазмиды. Эта плазмида может реплицироваться или в цитоплазме синхронно с бактериальной хромосомой, или как часть хромосомы в интегрированном с ней состоянии. Конъюгативные плазмиды обладают генами ira, которые определяют и (или) контролируют 1) образование отростков, называемых донорскими половыми ворсинками, которые обязательны (по крайней мере для большинства конъюгативных плазмид) для осуществления донорными клетками контакта с клетками реципиента 2) вещества, снижающие частоту конъюгации (спаривания) донора с донором, и 3) конъюгационный перенос плазмидной или хромосомной ДНК, начинающийся с определенного места (точка начала переноса) в молекуле конъюгативной плазмиды. Конъюгативные плазмиды имеют также гены, контролирующие 1) их репликацию, не связанную с половым процессом, 2) число копий плазмид в пересчете на эквивалент хромосомной ДНК и 3) функции несовместимости. В конъюгативных плазмидах могут также находиться гены, отвечающие за другие фенотипические признаки, такие, как устойчивость к антибиотикам, устойчивость к ионам тяжелых металлов, продукция бактериоцинов, поверхностных антигенов и энтеротоксинов. Конъюгативные плазмиды имеются, по-видимому, у всех грамотрицательных бактерий не так давно они были обнаружены у некоторых видов Streptomy es и Strepto o us. [c.101]

OM ОНИ способны передавать лишь с низкой частотой. Все хромосомные маркеры донора F+ передаются с примерно одинаковой частотой (около 10" на одну донорную клетку для любого маркера), и большинство образовавшихся трансконъюгантов наследует фактор F. Доноры Hfr передают хромосому направленно и последовательно начиная с генетически фиксированной точки, зависящей от места интеграции фактора F в бактериальной хромосоме. С самыми высокими частотами передаются те генетические маркеры, которые находятся вблизи точки начала переноса Hfr-хромосомы по мере удаления маркеров от этой точки частота их переноса и наследования пропорционально уменьшается. Такая картина наблюдается вследствие спонтанного случайного прекращения передачи хромосомы. За исключением редких случаев достаточно длительной конъюгации, когда возможен перенос всей Hfr-хромосомы, большинство трансконъюгантов, унаследовавших хромосомный материал Hfr, сохраняет генотип F , так как части интегрированной F-плазмиды передаются последними в качестве замыкающих маркеров. [c.102]

Рис. 4.2. Плазмида рМ0168 Е. соН — вектор с двумя точками начала репликации, способный экспрессировать большие количества мет-прохимозина прн температурах выше 37°С [4] (рисунок приводится с разрешения авторов).

Каждая группа использует по две случайные неохарактери-зованные вставки ТпЮ в хромосому Salmonella (полученные в эксперименте 1). Должно быть определено положение этих элементов Тп/0 на генетической карте и их ориентация. Идея заключается в том, чтобы встроить плазмиду (зТпЮ1ас+ в тот элемент Тп/0, который находится в хромосоме. Полученный в результате этого штамм Hfr скрещивают затем с различными реципиентами, определяя в результате точку начала его переноса и направление переноса. Таким образом, определяется локализация и ориентация последовательностей Тп/0 в хромосоме. [c.54]

Методы, используемые нами для синтеза равномерно меченных и меченных по концам одноцепочечных ДНК-зондов, очень похожи. Принцип их проиллюстрирован на рис. 10. Фрагмент ДНК, который предстоит исследовать, клонируется в репликативной форме бактериофага или в плазмидном векторе, продуцирующем одноцепочечные кольцевые молекулы только одной ориентации. Две наиболее распространенные системы такого типа — бактериофаг М13 и плазмиды, несущие точки начала репликации фага М13. Олигонуклеотидный праймер реассоциируют с одноцепочечной кольцевой молекулой так, чтобы он инициировал синтез ДНК на матрице тестируемой вставки в направлении от 5 - к З -концу. Для равномерно меченных зондов один из используемых при синтезе dNTP метится изотопами Р или в альфа-положении. Для зондов с концевой меткой олигонуклеотид метят по 5 -концу [y- PjATP, а для синтеза ДНК используют холодные dNTP. По окончании синтеза ДНК обрабатывается рестриктазой, расщепляющей кольцевую молекулу у конца вставки, противоположном сайту реассоциации с олигонуклеотидным праймером. В результате такой реакции получается линейный фрагмент ДНК, состоящий частично из двухцепочечного и частично из одноцепочечного участков. Денатурируя ДНК и проводя препаративный электрофорез в поли- [c.167]

Селективный марк81Жый ген для растений Бактериальный селективный маркерный ген Точка начала репликации плазмиды с широким кругом хозяев OS -сайт [c.28]

Полагают, что автономно реплицирующиеся последовательност (ARS), сообщающие стабильность плазмидам дрожжей, являютс точками начала репликации. Однако доказать это весьма сложи Трудность состоит главным образом в выделении достаточно для анализа количества определенных реплицирующихся молек) [c.142]

Рис. 9-17. Типичный пример плазмиды, содержащей точку начала репликации вируса SV40, после инкубации с Т-антигеном, белком, связывающимся с одноцепочечными молекулами (SSB-белок) и АТР (задача 9-20).

Кольцевые дрожжевые плазмиды, содержащие точку начала репликации, но лишенные центромеры, особым образом распределяются по отдельным клеткам. При культивировании клета в условиях, когда требуется синтез кодируемого плазмидой продукта, только от 5 до 25% клеток содержат плазмиды. В то же время число копий плазмид в этих несущих плазмиды клетках составляет от 20 до 50 на клетку. Чтобы разрешить кажущийся парадокс-большое среднее число копий при малой численноств содержащих плазмиды клеток,-вы проводите анализ родословной, намереваясь выяснить порядок распределения плаз1шад митозе. Эксперимент основан на использовании штамма дрожжей, нуждающихся в гистидине, и плазмиды, содержащей ген синтеза гистидина, которого нет у клетки-хозяина. Штамм, несущий плазмиду, хорошо растет в селективных условиях, т. е. прн отсутствии в среде гистидина. С помощью микроманипулятора вы разделяете материнские и дочерние клетки на протяжении пяти циклов делений в селективной среде, а затем определяете число клеток, способных образовать колонию. На рис. 13-1(1 [c.254]

Даже самые крупные вирусы не способны осуществлять биосинтетические процессы самостоятельно, они зависят в этом отношении ог клеток-хозяев. Среди известных нам вирусов ни один не имеет собственных рибосом и не обладает способностью синтезировать АТР, в котором он нуждается. Ясно поэтому, что клетки должны бьши появиться в процессе эволюции раньше вирусов. Предшественниками вирусов бьши, вероятно, небольшие фрагменты нуклеиновых кислот, которые приобрели способность размножаться независимо от хромосом их клеток-хозяев. Такие независимо размножающиеся элементы - их назвали плазмидами - реплицируются самостоятельно. Плазмиды встречаются как в ДНК-, так и в РНК-форме, и так же как вирусы, они содержат особую нуклеотидную последовательность, которая служит точкой начала репликации. Однако в отличие от вирусов они не способны синтезировать белок для построения белковой оболочки и, не имея такой оболочки, не могут свободно переходить из клетки в клетку. Многие из них не способны таосе включаться в хромосому клетки-хозяин а. [c.324]

Смотреть страницы где упоминается термин Точки начала плазмиды: [c.63] [c.252] [c.63] [c.60] [c.74] [c.74] [c.39] [c.404] [c.404] [c.97] [c.135] [c.97] [c.178] [c.28] [c.34] [c.130] [c.144] [c.255] [c.483] [c.96] [c.97] [c.135] [c.72]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология