Сэнгера метод секвенирования

Рис. 1.23. Схема метода секвенирования ДНК по Сэнгеру

В основе метода секвенирования ДНК, разработанного Сэнгером и соавт. [Sanger et al., 1977а], называемого также методом секвенирования путем терминации цепи, лежал принцип ферментативного построения комплементарной цепи ДНК по существующей одноцепочечной матрице при происходящем в разных местах цепи ДНК ингибировании ее дальнейшего роста. [c.46]

Первый метод секвенирования ДНК, предложенный Ф. Сэнгером и А. Коулсоном в 1975 г, основан на ферментативных реакциях и носит название плюс-минус -метод. Данный подход предполагает выделение одноцепочечного фрагмента ДНК, соответствующего исследуемому участку генома. Этот фрагмент используют затем в реакции полимеразного копирования в качестве матрицы, а в качестве праймера — синтетические олигонуклеотиды или природные субфрагменты, получаемые после гидролиза определенными рестриктазами. [c.36]

СЕКВЕНИРОВАНИЕ ДНК ФЕРМЕНТАТИВНЫМ МЕТОДОМ ПО СЭНГЕРУ [c.44]

В настоящее время существует множество вариантов как метода Максама — Гилберта, так и метода Сэнгера. Главное, эти методы удалось полностью автоматизировать. Так, например, при секвенировании ДНК по Сэнгеру на 5 -конец праймера вводят флуоресцентные метки, причем для каждого из четырех анализируемых нуклеотидов используются флуоресцирующие агенты с различными спектральными характеристиками. После электрофоретического разделения гель сканируется при четырех различных длинах волн и полученная информация сразу обрабатывается на ЭВМ. При этом все биохимические операции также проводятся роботом. [c.19]

Хотя сам принцип специфической терминации, положенный в основу первоначального метода секвенирования ДНК с помопц.ю дидезок-ситерминаторов, остался неизменным, само секвенирование ДНК по Сэнгеру все же стало в значительной степени другим. Причем для описания всех этих последовательных усовершенствований одной главы оказалось недостаточно и, кроме главы 2, целиком посвященной этому методу, еще ряд глав (глава 3. ПЦР-секвенирование ДНК глава 9. Автоматическое секвенирование ДНК) имеют к ферментативному методу секвенирования ДНК самое непосредственное отношение. Разработки векторов для молекулярного клонирования и стратегий секвенирования (главы 7 и 8 соответственно) также в большей степени ориентированы на ферментативное секвенирование. В связи с разделением нами в главе 7 векторов для молекулярного клонирования на несколько поколений следует отметить, что оно, конечно же, условно хотя бы по той причине, что огромная группа специализированных векторов оказалась не включенной в приведенную схему. Подробное рассмотрение стратегий секвенирования объясняется тем, что именно от их выбора часто зависит общая производительность метода секвенирования ДНК. [c.10]

Наиболее широко сейчас применяется метод ферментативного секвенирования, или метод секвенирования путем терминации (остановки синтеза) цепи, предложенный Ф. Сэнгером в 1977 г. (рис. 1.3, а). В основе [c.30]

Секвенирование ДНК по Сэнгеру. Это наиболее употребительный метод секвенирования ДНК, поскольку по сравнению с химическим методом он позволяет анализировать более крупные фрагменты ДНК с меньшей вероятностью ошибки. Секвенируемую ДНК сначала клонируют в одноцепочечный бактериофаговый вектор, который может функционировать в Е. соН. Чаще всего используют фаг М13 и его производные [13]. Одноцепочечная ДНК взаимодействует как субстрат с ДНК-поли-меразой, которая точно копирует первую цепь. Однако если нормальный дезокси-нуклеозидфосфат заменить его аналогом-дидезоксинуклеозидфосфатом, то дальнейшее функционирование полимеразы прекращается и рост синтезируемой цепи останавливается. Для инициирования этого процесса используют химически синтезированный универсальный нуклеотидный праймер. Реакцию проводят в присутствии четырех аналогов dNTP, один из которых содержит метку Р. Исходно имеется четыре реакционные смеси, в каждой из которых понижена концентрация одного из аналогов меченого нуклеотида. Поэтому в результате реакции получаются смеси меченных радионуклидами фрагментов ДНК, один конец у которых одинаков, но при этом они имеют разную длину и разные основания на другом конце. После инкубации ДНК в каждой смеси превращается в одноцепочечную форму. Затем смеси подвергают электрофорезу в полиакриламидном геле. Длину и последовательность фрагментов ДНК можно считывать непосредственно с гелевого слоя. Этот метод позволяет секвенировать в одной серии реакции от 250 до 500 пар оснований. Полученные данные часто анализируют с помощью компьютера. [c.95]

Современные методы секвенирования (метод химической деградации ДНК Максима — Гилберта и метод синтеза ДНК на матрице в присутствии терминаторов синтеза Сэнгера) в своей основе разработаны в 1977 г. Идея методов состоит в следующем [c.284]

Встраивание генов неизвестного строения в ДНК фага М13 приводит к получению ДНК, у которой наряду с хорошо известной последовательностью имеется фрагмент неустановленной структуры. Такая конструкция очень удобна для установления первичной структуры встроенного фрагмента методом Сэнгера (см. 7.8). Этот подход становится одним из основных для подготовки фрагментов ДНК самого разнообразного происхождения к заключительной фазе секвенирования. [c.306]

Практически параллельно с методом Максама — Гилберта был развит другой метод секвенирования ДНК, получивший по имени создавшего его автора название метод Сэнгера. Этот метод считается наиболее перспективным для исследования первичной структуры больших молекул нуклеиновых кислот, вплоть до ДНК хромосом человека. В бго основе лежит анализ структуры не самой нуклеиновой кислоты, а продукта, получаемого в ходе ее репликации с помощью ДНК- юлимеразы. Аналогично, используя обратную транскрипцию, с помощью РНК-зависимой ДНК-полимеразы можно анализировать структуру молекул РНК. [c.281]

МО иметь большое количество идентичных молекул ДНК. Наработку интересующей последовательности можно осушествить клонированием соответствующего фрагмента. Проиллюстрированный на рис. 36.6 метод секвенирования по Максаму-Гилберту основан на химическом расщеплении ДНК по определенному основанию. Другой ферментативный метод—метод Сэнгера—базируется на применении аналогов нуклеотидов, прерывающих синтез комплементарной цепи ДНК по одноцепочечной матрице в месте встраивания в цепь соответствующего аналога. [c.44]

Третьим достижением стала разработка методов клонирования ДНК (гл. 30), которые сделали возможным получение достаточно больших количеств чистьгх генов-исходного материала для секве-нирования. Было предложено два принципиальных подхода к секвенированию ДНК, у каждого из которых есть ряд вариантов. Фредерик Сэнгер, первым определивший аминокислотную последова- [c.887]

Пожалуй, ключевым моментом ферментативного метода секвенирования ДНК, разработанного Сэнгером и соавт. [Sanger et al., 1977], является образование специфически терминированных меченых фрагментов вновь синтезированной ДНК. Такая терминация построения комплементарной цепи ДНК происходит при включении ДНК-полимеразой в растущую цепь ДНК-модифицированных аналогов природных [c.109]

В ферментативном методе секвенирования ДНК по Сэнгеру каждая дорожка соответствует только одному конкретному типу оснований (рис. 6.2) и поэтому для правильного прочтения радиоавтографа секвенирующего геля необходимо следить, чтобы какая-либо полоса содержалась только в одной дорожке, поскольку в противном случае точное установление данного нуклеотида будет затруднено или скорее просто невозможно. В связи с тем, что в отличие от картины полос секвенируемой ДНК по Максаму Гилберту в методе Сэнгера нет необходимости сопоставления наличия полос пуриновых или пиримидиновых оснований в одной или двух дорожках, то можно считать, что чтение радиоавтографа секвенирующего геля при этом будет несколько проще. [c.200]

Надо отметить относительную простоту процедур, требующихся для определения последовательности нуклеотидов ДНК данным методом, особенно по сравнению с секвенированием ДНК, основанным на полимеризации (метод Сэнгера) и деградации (метод Максама-Гилбер-та). Однако, к сожалению, существует ряд ограничений, из-за которых метод секвенирования ДНК гибридизацией так и не стал основным. Пожалуй, главными препятствиями этому служат серьезные проблемы при секвенировании повторяющихся элементов генома и чтение относительного малого числа нуклеотидов в ходе одного эксперимента. (Теоретически существующие возможности повышения разрешающей [c.400]

Чтобы не перегружать рисунки и не устраивать непроходимую чащу и одновременно не делать болшое их количество, мы решили стандартное секвенирование ДНК уместить всего в 3 рисунках, условно разделив весь процесс на две стадии. К первой оказалось отнесено все то, что предшествует электрофоретическому разделению продуктов секвенирующих реакций. Вторая стадия состоит из самого электрофореза и некоторых последующих процедур. Таким образом, нарисованными оказались только все вариации двух классических методов секвенирования ДНК по Максаму-Гилберту и Сэнгеру. [c.417]

Разработка быстрых методов секвенирования сделала возможным определение нуклеотидных последовательностей крупных молекул ДНК, а не только их фрагментов. В 1978 г Ф. Сэнгер с соавторами опубликовали первую полную последовательность геномной одноцепочечной ДНК бактериофага 0X174, имеющей размер 5386 нуклеотидов. Следующий рубеж был преодолен при определении нуклеотидной последовательности митохондриальной ДНК человека (16 569 пн) в 1981 г. Серьезным успехом явилось определение полной нуклеотидной последовательности ДНК бактериофага Я, состоящей из 48 502 пн. В 1992 г. С. Н. Щелкунов с соавторами вручную методом Максама-Гилберта секвенировали геном вируса натуральной оспы (186 тпн). До 1995 г. наиболее крупными геномами с известной последовательностью нуклеотидов были ДНК цитомегаловируса (229 тпн) и ДНК вируса осповакцины (192 тпн). [c.45]

Таким образом, целая череда знаменательных событий в молекулярной биологии привела к долгожданной возможности определения последовательности нуклеотидов в молекулах ДНК. Получение с помогцью предложенных методов секвенирования ДНК совергпенно новых сведений в виде генетических текстов, ранее недоступных, оказало настолько значительное влияние на развитие не только самой молекулярной биологии, но и обгцей биологии и других смежных областей знаний, что заставило по-новому взглянуть на планирование и проведение экспериментов, на адекватность получаемых результатов поставленным задачам, вызвала к жизни разработку соответствуюгцего компьютерного обеспечения и пр. Словом, вся биологическая наука и связанные с ней дисциплины получили благодаря этим методам очень могцный импульс. Поэтому вполне оправданным выглядит решение Нобелевского комитета о присуждении в том же 1980 г. Нобелевской премии по химии У.Гилберту и Ф.Сэнгеру [c.15]

Рис. 11.15. Исходная структура однонитевого вектора М13 со вставкой клонированной ДНК и олигонуклеотидом-затравкой, испоЛьзуемая при секвенировании по методу Сэнгера (А). Пунктирная стрелка указывает направление последующего синтеза комплементарной нити. Продукты элонгации затравки в присутствии ddATP, останавливающего рост синтезируемой нити в точках, соответствующих А-аденину (Б)

Были опубликованы подробные описания методик с использованием РНК-полимераз фагов Т7, SP6 [27] и фага ТЗ [9]. Суть метода состоит в использовании З -дезоксианалогов рибо-нуклеозидтрифосфатов в низких концентрациях, чтобы синтезируемые молекулы РНК статистически терминировались при включении модифицированных оснований. Затем, используя стандартные гели, определяют нуклеотидную последовательность РНК, причем и принципиально, и методически такое секвенирование идентично методу Сэнгера. [c.37]

Основное преимущество фага М13 как вектора заключается в том, что выделяемые клеткой частицы бактериофага содержат одноцепочечную ДНК, гомологичную одной из двух комплементарных цепей клонируемой ДНК. Такая ДНК непосредственно может быть использована для определения последовательности оснований ДНК (секвенирование) по методу Сэнгера (диде-зоксиметод). [c.152]

Простота, с которой можно получить четкие надежные данные, не прибегая к клонированию в бактериях, определяется 1) способностью ПЦР-затравок амплифицировать только интересующие последовательности (специфичность праймера) и 2) способом получения образца, приемлемого для секвенирования. Для прямого секвенирования продуктов ПЦР вполне пригоден химический метод (Максама — Гилберта). Мы рассмотрим здесь только наиболее распространенный метод Сэнгера, использующий нуклеотиды-терминаторы полимеразной реакции. Специфичность ПЦР-затравок в принципе определяет гомогенность амплифицируемых последовательностей. В идеале, в результате реакции экспоненциально наращивается только интересующая последовательность. Однако в реальных условиях многие праймеры амплифицируют также различные посторонние последовательности. Повышая температуру отжига в полимеразной реакции, это осложнение удается преодолеть [12]. К тому же для устранения затруднений, связанных со свойствами конкретной амплифицируемой последовательности, можно применить предварительную очистку интересующей последовательности электрофорезом в геле или использовать денатурирующий градиентный гель [15]. [c.185]

Для секвенирования ДНК по методу Сэнгера ее клонируют в однонитевых фагах. Основа метода Сэнгера — синтез радиоактивных копий однонитевой ДНК от фиксированного олигонуклеотида-затравки в присутствии нуклеотидспецифичных терминаторов синтеза ДНК. Чтобы облегчить выделение однонитевых матриц, Дж. Мессингом сконструирована серия векторов на основе фага М13, содержащего в капсидах однонитевую ДНК. Биология размножения М13 чрезвычайно удобна для создания таких векторов. М13 реплицируется в клетке в виде двунитевой репликативной формы, которую можно легко выделить и использовать для клонирования чужеродной ДНК как обычную плазмидную ДНК. В то же время такие рекомбинантные клоны выделяют и из суспензии зрелых частиц фага в однонитевой форме. Сконструированные Мессингом векторы содержат полилинкер, т. е. последовательность, являющуюся мишенью для нескольких рестриктаз, для клонирования ДНК в области фагового генома несущественной для его размножения кроме того, при вставках чужеродной ДНК изменяется цвет фаговых негативных колоний (пятен лизиса на газоне бактериальной культуры) на среде с индикаторным красителем. Для секвенирования олигонуклеотид- [c.285]

Термостабильная Гй(7-ДНК-полимераза в настоящее время широко применяется для проведения ПЦР (см. главу 6.1), а ее модифицированный (мутантный) аналог, для которого характерно многократное повышение сродства к терминирующим синтез ДНК дидезоксирибонуклеозидтрифосфатам, - для секвенирования ДНК по методу Сэнгера. [c.63]

Определение нуклеотидной последовательности, или секвенирование ДНК, стало возможным лишь в последние годы. К 1977 г. было разработано два метода секвени-рования ДНК химический метод Максама и Гилберта [12] и метод Сэнгера [15], [c.94]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология