Нуклеазы рестрикции

В клетке межнуклеотидные связи в ДНК и РНК расщепляются нуклеазами — обширным классом ферментов, представители которого различаются по механизму действия и специфичности (табл. 1), Среди нуклеаз, приведенных в таблице, нужно особо выделить эндонуклеазы рестрикции (рестриктазы). ферменты (их функции рассмотрены в гл. VI) узнают в молекулах ДНК не отдельные нуклеотидные остатки, а нуклеотидные последовательности из четырех, пяти или шести остатков и поэтому расщепляют любую ДНК на сравнительно небольшое число строго определенных фрагментов. [c.13]

Рис. 30.1. Благодаря нуклеосомному фазированию сайты рестрикции попадают в уникальные положения линкерных участков, которые разрезаются нуклеазой микрококков.

Рассмотрим последовательность только для одной нуклеосомы. При расщеплении нуклеазой микрококков образуется мономерный фрагмент, состоящий из специфической последовательности. Если выделить ДНК и расщепить ее рестриктирующим ферментом, для которого имеется только один сайт рестрикции на этом фрагменте, то ДНК будет разрезана только в одной точке. При этом образуются два фрагмента, каждый с уникальным размером. Продукты двойного расщепления нуклеазой микрококков и рестриктирующим ферментом разделяют с помощью электрофореза в геле. Для идентификации фрагментов, образованных в результате двойного расщепления, используют специальный зонд, представляющий собой последовательность ДНК, непосредственно примыкающую к сайту рестрикции (с одной стороны). Этот метод называют непрямым концевым мечением (не совсем соответствующее название). [c.377]

Иначе говоря, идентификация одной четкой полосы показывает, что положение сайта рестрикции однозначно определено по отношению к концу нуклеосомной ДНК (который соответствует разрезу нуклеазой микрококков). Таким образом, нуклеосома обладает уникальной последовательностью ДНК. [c.377]

В большинстве случаев экспериментальные данные не получаются такими четкими, как в опыте, показанном на рис. 30.1 для однозначного расположения нуклеосом. Но иногда они достаточно сильно отличаются от широких полос или размазанных пятен, предполагаемых для случайной локализации. Из этих экспериментов действительно следует, что число сайтов разрезания нуклеазой микрококков ограничено немногими положениями по отношению к конкретным сайтам рестрикции. Следовательно, можно предположить, что образование нуклеосом ограничено таким способом, который позволяет им находиться только в немногих (2-4) альтернативных фазах. [c.378]

Селекцию векторов, полученных путем делеции или изменения одного сайта рестрикции (путем удаления последовательностей ДНК, содержащих один сайт рестрикции, лигирования липких концов, образующихся под действием различных рестриктаз, гидролиза одного сайта рестрикции нуклеазой Ва/31 или гидролиза липких концов нуклеазой 51 и последующего лигирования по тупым концам), выполняют следующим образом [c.83]

Исходный димер объединяемых генов состоит из генов 1 и 2, объединенных линкером, содержащим подходящие сайты рестрикции (/) димер фрагментируют ДНКазой I и образовавшиеся концы затупляют нуклеазой S1 (2) отбирают фрагменты, размер которых соответствует длине одного гена плюс длина линкера, (3) переводят их в кольцевую форму лигированием по тупым концам и 4) линеаризуют с помощью рестриктазы по сайту, который находится в линкере образующаяся в итоге библиотека генов содержит гибридные молекулы ДНК, кодирующие N-концевую часть белка 2 и С-концевую часть белка 1 (5) химерные гены клонируют в экспрессирующем векторе сразу или после амплификации с помощью ПЦР с использованием по одному из праймеров, комплементарных концам объединяемых генов, которые соседствуют с линкером, и после экспрессии химерных генов получают клонотеку химерных белков [c.330]

Уже сейчас разнообразие нуклеотидных последовательностей, узнаваемых специфическими нуклеазами, представлено большим числом вариантов. Работа по поиску рестриктаз далеко не завершена. С каждым годом появляются ферменты с новой субстратной специфичностью и пока не видно признаков снижения темпов роста их числа (см. табл. 2). Вариабельность структуры узнаваемых последовательностей в настоящее время уже такова, что кажется вполне вероятным со временем обнаружить рестриктазу для любой последовательности нуклеотидов, по меньшей мере являющейся производным типов, представленных в табл. 8. Интенсивное развитие работ по поиску новых ферментов рестрикции позволяет надеяться, что со временем будет получен ответ и на этот вопрос. [c.41]

Индивидуальная рестрицирующая нуклеаза способна разрезать двойную спираль ДНК любой длины с образованием серии фрагментов, называемых рестрикционными фрагментами (рестриктами). Сравнение размеров фрагментов ДНК, полученных после обработки определенного участка генома набором рестрицирующих нуклеаз, позволяет построить рестрикционную карту, на которой указано положение каждого сайта рестрикции относительно других рестрикционных участков (рис. 4-61) Поскольку рестрикционная карта отражает расположение определенной последовательности нуклеотидов в данном участке, сравнение таких карт для двух или более родственных генов позволяет приближенно оценить гомологию между ними. Отсюда следует, что можно проводить сравнение различных участков ДНК (сравнивая их рестрикционные [c.230]

Рис. 4-61. Простой пример, иллюстрирующий взаимное расположение на двойной спирали ДНК участков узнавания для различных рестрицирующих нуклеаз (именуемых также сайтами рестрикции ), совокупность которых образует рестрикционную карту Заключение фермент А расщепляет вблизи одного из концов молекулы. Фермент Б должен расщеплять вблизи того же конца либо вблизи другого конца. Размеры фрагментов, образующихся при расщеплении 2 ферментами исключают первое предположение и позволяют установить порядок сайтов рестрикции, указанный ниже

II не нуждаются в АТР. Самое удивительное, что места расщепления нуклеазами типа II весьма специфичны. Как уже обсуждалось в одной из предыдущих глав (разд. 24.27), многие из этих ферментов узнают определенную последовательность из 4-6 пар оснований и гидролизуют в каждой цепи единственную строго определенную фосфодиэфирную связь в этой области. Отличительная особенность этих участков расщепления состоит в том, что они симметричны относительно оси вращения второго порядка (рис. 30.18). Ферменты рестрикции - незаменимый инструмент в исследовании структуры ДНК (разд. 24.27) и создании новых молекул ДНК (разд. 31.9). [c.178]

Т 2, Т4 и Тб) вместо цитозина входит оксиметилцитозин, большин-ст во остатков которого к тому же еще глюкозилированы. ДНК, мо-ди фицированную подобным образом, не разрезают почти все известные рестриктазы. Такой способ борьбы с рестрикцией могут позволить себе лишь крупные фаги, поскольку для этого фаг должен кодировать фактически новый метаболический путь синтеза необычных нуклеотидов, а также новые ферменты синтеза ДНК, адаптированные к необычным свойствам фаговой матрицы и к использованию необычного субстрата. Зато столь радикальная модификация ДН К позволяет фагам, использующим эту тактику, не только защищаться от хозяйских рестриктаз, но и пойти дальше они коди-р уют нуклеазы, деградирующие немодифицированную ДНК хозяина, но не действующие на фаговую ДНК. Другие фаги используют еще ряд способов борьбы с системой рестрикции хозяина. [c.133]

Уже давно было известно, что в бактериальной ДНК среди миллионов обычных оснований (А, Т, G и С) встречаются основания, несущие дополнительные метильные группы. Биологическое значение этих метилированных оснований стало понятным в результате ряда важных открытий, которые оказали большое влияние на развитие генетики и, в частности, биохимической генетики. Для каждого вида бактерий характерна своя особая картина распределения метилированных оснований по ДНК, отличающая ее от ДНК других видов. Если ДНК какого-либо другого вида каким-то образом проникнет в живую бактериальную клетку, то она будет признана там чужеродной именно по отсутствию в ней специфической для данного вида картины распределения метилированных оснований, присущей ДНК клеток этого вида. В такой ситуации чужеродная ДНК будет разрушена специфической нуклеазой, которая расщепляет обе цепи ДНК непосредственно в том месте, где отсутствуют характерные для ДНК клетки-хозяина метилированные основания, или вблизи этого места. Таким образом чужеродные ДНК подвергаются рестрикции они разрушаются с помощью специфических ну-клеаз, вырабатываемых каждым видом бактерий. [c.880]

Этот первый метод выделения генов был разработан в конце 1960-х — начале 1970-х гг. Его появление стало возможным благодаря открытию ферментов, называемых рестрикционными (от англ. restri ting — ограничивающий) эндонуклеазами или рестриктазами. Эти ферменты обнаруженные в бактериях, способны разрезать ДНК, например они разрезают любую вторгающуюся в бактериальную клетку вирусную ДНК, ограничивая (рестрицируя) таким образом размножение вирусов внутри клетки. Разные виды бактерий продуцируют различные рестрикционные эндонуклеазы. Каждая из них разрезает нуклеиновую кислоту (отсюда, нуклеаза ) в строго определенных точках ( эндо означает, что фермент разрезает молекулу изнутри, а не атакует ее с концов). Фермент распознает некую последовательность оснований и взаимодействует именно с ней. Точки разрезания называются сайтами рестрикции. К настоящему времени выделено более 2000 рестриктаз, активных в отнощении 230 разных последовательностей. Свою собственную ДНК бактерия защищает путем присоединения к определенным основаниям в сайтах рестрикции метильной группы. [c.219]

Рис. 5-90. Выявление полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ) блот-анализом по Саузерну Для простоты в хромосомах показано лишь несколько сайтов рестрикции, хотя в действительности их многие тысячи. Если до воздействия рестрицируюшей нуклеазой провести амплификацию соответствуюш,его участка методом ПЦР, этот же тест можно провести без радиоизотопов и от блот-анализа отказаться

Появившиеся в последнее время методы позволяют составлять подробные карты очень больших геномов. Есть две категории карт 1. Физические карты, основывающиеся на строении молекул ДНК, составляющих каждую хромосому. Сюда относятся рестрикционные карты и систематизированные библиотеки клонов геномной ДНК. 2. Карты генетического сцепления их строят, основываясь на частоте совместной передачи потомству двух или нескольких признаков - генетических маркеров, различных у отца и матери и приписываемых определенному участку хромосомы. В качестве маркеров издавна принято использовать те гены, экспрессия которых обнаруживается по их эффекту (таковы, в частности, гены, вызывающие генетические болезни, например мышечную дистрофию). Разработанные сравнительно недавно новые методы с применением рекомбинантной ДНК дали возможность использовать в качестве генетических маркеров короткие последовательности ДНК, содержащие один из сайтов рестрикции и различающиеся у отдельных индивидуумов, такие последовательности особенно удобны для генетического картирования, потому что под действием рестрикционной нуклеазы возникают фрагменты, различающиеся по своей длине, и этот полиморфизм длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ) легко может быть выявлен блот-анализом по Саузерну с помощью подходящего ДНК-зонда (рис. 5-90). [c.342]

На первом этапе происходит выщепление плеча сшивки ферментами uvr-системы — системы эксцизии, на втором — защита однотяжевого участка от действия нуклеаз с помощью фермента рестрикции-модификации (RMh), который в обычных условиях обеспечивает клетке способность узнавать и разрушать чужеродную ДНК, на третьем — заполнение бреши в ходе синтеза de novo при помощи продуктов генов гее А и lex А. Если же в клетке представлен второй геном, неповрежденный в данном сайте, то заполнение бреши идет рекомбинационным путем, контролируемым продуктами гена гес А. [c.303]

Ген, клонированный в плазмиде, расщепляют по уникальному сайту рестрикции и образовавшиеся линейные молекулы ДНК инкубируют в присутствии экзонуклеазы Ва13. При этом экзонуклеаза последовательно удаляет нуклеотиды с обоих концов ДНК, причем количество удаляемых нуклеотидов прямо пропорционально времени инкубации ДНК с нуклеазой, а также зависит от температуры инкубации и концентрации фермента. В результате подобного действия образуется набор фрагментов ДНК разной длины, содержащих делеции различных размеров по обе стороны выбранного сайта рестрикции. К тупым концам Таких молекул ДНК с помощью ДНК-лигазы присоединяют Двухцепочечные олигонуклеотидные линкеры, содержащие уникальный (часто исходный) сайт рестрикции, обрабатывают соответствующей рестриктазой, замыкают молекулы в кольцо по- едством лигирования и затем вводят их в бактериальные клетки. Точное картирование концов делеций осуществляют секвени-рованием соответствующих участков ДНК мутантных плазмид. В результате получают набор делеций разного размера, положе- [c.287]

Работа по созданию таких клонотек начинается с объединения двух генов в виде димера голова к хвосту , между которыми находится короткая линкерная последовательность, содержащая нужные сайты рестрикции (рис. 44, стадия 1). Димеры фрагментируют случайным образом, инкубируя их с ДНКазой I, образовавшиеся концы молекул затупляют нуклеазой S1, а сами фрагменты ДНК фракционируют по размерам, отбирая молекулы, длина которых соответствует размерам одного из исходных генов (стадия 2). Далее осуществляют внутримолекулярное лигирование этих фрагментов по тупым концам (стадия 3), что сопровождается образованием кольцевых молекул ДНК, которые далее линеаризуют с помощью рестриктаз по последовательности линкера (стадия 4). Итоговые гибридные молекулы ДНК кодируют N-концевую часть белка 2 и С-концевую часть белка 1, которые могут быть синтезированы в виде единой полипептидной цепи в результате экспрессии рекомбинантных генов после их клонирования в составе экспрессирующего плазмидного вектора. При этом, соотношение последовательностей двух объединяемых белков в составе гибридных молекул варьирует в широких пределах. [c.332]

Образование делеций. Ранее уже отмечалось, что делеции и вставки размером в несколько десятков нуклеотидных пар можно получить методами с использованием олигонуклеотидов. Делеции и вставки размером в несколько нуклеотидных пар можно получить, удаляя выступающие концы рестриктов нуклеазой S1 или заполняя их ДНК-полимеразой. В результате после воссоединения рестриктов ДНК-лигазой фага Т4 в молекулах ДНК появляются микроделеции или микровставки. При желании увеличить размеры делеций концы рестриктов дополнительно обрабатывают подходящими экзонуклеазами. К большим делениям приводит удаление из фрагмента ДНК л тка, находящегося между двумя сайтами рестрикции, последов т " ным действием рестриктазы и лигазы. [c.264]

Разработка изящной методики клонирования ДНК для получения большого количества точных копий специфических фрагментов ДНК (рис. 13.4) открыла в последнее время новые горизонты в изучении структуры, организации и функцип генома. Если расщепить двухцепочечиую ДНК одним из ферментов рестрикции (одной из нуклеаз), специфично узнающих и расщепляющих короткие последовательности нуклеотидов (4— [c.454]

Основным требованием при использовании рестриктаз в генно-инженерных и других молекулярно-генетических экспериментах является функциональная чистога, а именно, отсутствие примесей неспецифических нуклеаз и фосфатаз. Поэтому, основные усилия при выделении и очистке рестрикционных эндонуклеаз направлены на получение функционально чистых их препаратов. Однако, для структурно-кинетических исследований эндонуклеаз рестрикции требуются относительно больщие количества гомогенных препаратов ферментов. Несмотря на то, что как уже отмечалось, в настоящее время охарактеризовано (и в большинстве случаев выделено) более 1000 рестриктаз, лишь небольшая их часть получена в го(могенном состоянии. [c.66]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология