Элюирование аффинное

До настоящего времени аффинный сорбент не использовали повторно, но если разработать метод элюирования белка без фотолиза, так чтобы сорбент можно было снова использовать, то это откроет путь широкому применению этому адсорбционному методу для очистки В12-зависимых ферментов. [c.395]

Преимуществом колоночной хроматографии является возможность количественного фракционирования больших количеств веществ без превращения их в какие-либо производные. Однако хорошее разделение часто возможно лишь при малых скоростях элюирования, поэтому были разработаны новые виды колоночной хроматографии. Методы аффинной и адсорбционной хроматографии основаны на избирательной адсорбции молекул на нерастворимом адсорбенте, который содержит группы (молекулы), специфически взаимодействующие с молекулами подлежащих очистке соединений, например ингибиторы (для очистки ферментов) или антитела (для очистки антигенов) в настоящее время эти методы нашли широкое применение и для разделения углеводов. Невзаимодействующие с адсорбентом примеси удаляются, а связанный с адсорбентом сахар затем десорбируют способом, не приводящим к его разрушению. Десорбцию можно осуществить, изменяя pH, ионную силу среды или применяя соответствующий ингибитор взаимодействия, удерживающего вещество на адсорбенте. Для разделения ряда полисахаридов были использованы иммобилизованные формы (см. разд. 26.3.7.6) конканавалина А [40], являющегося фитогемагглютинином (лектином), который специфически взаимодействует с разветвленными полисахаридами определенного строения в настоящее время применяют и другие иммобилизованные фитогемагглютинины. Колоночная хроматография на носителях, покрытых полиароматическими соединениями [41], также находит применение для разделения полисахаридов. Благодаря достижениям в производстве носителей для жидкостной хроматографии под высоким давлением можно осуществить хроматографическое разделение быстро и избирательно описаны методы фракционирования небольших олигосахаридов, продолжающегося менее 1 ч [42]. [c.224]

Аффинная хроматография (хроматография по сродству). Основана аффинная хроматография на принципе избирательного взаимодействия белков (или других макромолекул) с закрепленными (иммобилизованными) на носителе специфическими веществами-лигандами, которыми могут быть субстраты или коферменты (когда выделяют какой-либо фермент), антигены (или антитела), гормоны или рецепторы и т. д. Благодаря высокой специфичности белков к иммобилизованному лиганду, связанному с носителем (которым заполняют хроматографическую колонку), присоединяется только один какой-либо белок из смеси. Снятие с колонки этого белка осуществляют элюированием буферными смесями с измененным pH или [c.29]

Рис. 36.10. Профиль элюирования ацетилхолинэстеразы на колонке с аффинным сорбентом [67].

Именно при изучении влияния микроокружения на специфические взаимодействия важную роль начинает играть метод аффинной хроматографии. Как подробно показано в гл. 4, возможно, напри.мер, использовать колонку с иммобилизованным ингибитором н вытеснять специфически сорбируемый фермент растворами его ингибиторов в различных концентрациях. Па основе объемов элюата могут быть рассчитаны константы диссоциации фермента как со связанным, так и с растворенным ингибитором. Если использовать тот же ингибитор для связывания на нерастворимой подложке и для элюирования специфически сорбированного фермента, то информацию о влиянии окружения на образование комплекса можно получить, основываясь на различиях, если таковые имеются, в величинах определяемых констант диссоциации. Поскольку специфические взаимодействия играют очень важную роль в большинстве процессов, протекающих в природе, разработка простого метода определения констант диссоциации комплексов несомненно имеет важное значение. [c.12]

Использование аффинной хроматографии для определения, например, констант ингибирования ферментов, по-видимому, весьма перспективно. Данные об объемах элюатов, содержащих фермент, на колонке с иммобилизованным ингибитором, полученные при использовании различных концентраций ингибитора в растворе, позволяют определить константы ингибирования как для связанного ингибитора, так и для ингибитора в растворе. Метод детально рассмотрен в гл. 4. Большое преимущество этого метода состоит в том, что при использовании одного и того же ингибитора как для иммобилизации, так и для элюирования можно непосредственно сделать выводы о влиянии связей с носителем и природы носителя на изучаемое взаимодействие на основании совпадения или различий в определяемых величинах констант диссоциации. Следовательно, метод аффинной хроматографии открывает новые возможности не только для изучения взаимодействия биологически активных веществ, он перспективен также и для выяснения влияния микроокружения на образование этих комплексов. [c.19]

Как указывалось в гл. 2 (рис. 2.1), специфически сорбированный выделяемый фермент может быть освобожден из комплекса с пришитым аффинным лигандом либо при помощи раствора конкурентного ингибитора (биоспецифическое элюирование), либо при изменении среды. Последний метод является более общим как правило, меняют pH или ионную силу раствора. Хотя влияния таких изменений могут иметь сложный характер, Грейвс и Ву [3], выводя закономерности для освобождения фермента с аффинного [c.26]

Другим наиболее часто применяемым методом освобождения фермента из его комплекса со связанным лигандом является элюирование фермента раствором конкурентного ингибитора. При этом основное требование состоит в сохранении значения Кь в ходе процесса элюирования. Уравнения (3.1) и (3.2), описывающие равновесие между ферментом и связанным аффинным лигандом, необходимо дополнить [c.30]

Сорбция, промывка и элюирование ферментов с использованием колоночной аффинной хроматографии описываются с помощью уравнений, выведенных для модели одноразовой сорбции и элюирования путем изменения Кь (рис. 3.7). Из рис. 3.7, а хорошо видно, что при /Сь=10 моль/л значительная потеря фермента (61,6%) происходит при промывках. Элюирование при Кь, равных [c.32]

Разновидность количественной аффинной хроматографии — фронтальный анализ [10] он основан на понятии плотности о аффинного лиганда на единицу длины колонки с агарозой. Если / — общая длина колонки с агарозой, а Li — общее количество им мобилизованного лиганда в сорбенте, то о = - г/ - Если аффинный сорбент характеризуется слабым сродством, то раствор фермента в концентрации [ 0] наносится на колонку непрерывно, а для элюирования фермента с колонки необходим объем V. Можно написать следующее уравнение [c.51]

ВЫСОКОЙ концентрацией аффинного лиганда является слишком сильное взаимодействие с выделяемым вешеством, что затрудняет его элюирование. Так, например, тщательный контроль концентрации лиганда имеет решающее значение для выделения глюкокиназы на агарозе со связанной N-(6-аминогексил)-2-амино-2-дез-оксн-D-глюкопиранозой [14] (рис. 5.6). [c.81]

Влияние температуры на сорбцию и элюирование выделяемых аффинной хроматогра( )ией веществ рассмотрено далее (гл. 10). В заключение этого раздела следует подчеркнуть, что всегда следует помнить о влиянии температуры, поскольку воспроизводимые результаты можно получить, только если температура тщательно контролируется особенно это касается аналитических приложений аффинной хроматографии. [c.89]

ЭЛЮИРОВАНИЕ КОНКУРЕНТНЫМИ АФФИННЫМИ ЛИГАНДАМИ [c.92]

Биохимическая характеристика [12]. -адренэргического рецептора (Pi), как и никотинового ацетилхолинового рецептора, оказалась возможной благодаря двум счастливым открытиям. Так, обнаружилось, что эритроциты птиц являются богатым исходным хматериалом этих рецепторов и что детергент дигитонин растворяет рецептор, не дезактивируя его. Эритроциты индюка содержат 0,2 пмолей -рецептора/мг мембранного белка ме-тодом аффинной хроматографии яе только можно очистить его в 12 ООО раз, но и (как ясно показывает кривая элюирования на рис. 9.10, а) отличить от аденилатциклазы, которая не является составной частью рецептора, а представляет собой отдельную субъединицу. Ранее аналогично был выделен аффинной хроматографией GTP-связывающий компонент. [c.271]

Элюирование из колонки в аффинной хроматографии может вызываться каким-либо растворимым аффиантом, образующим более прочное соединение с выделяемым веществом, чем привитые аффинные лиганды, изменением ионной силы раствора или температуры. В наиболее общем случае элюирование достигается путем изменения pH раствора, приводящего к подавлению диссоциации функциональных групп, ответственных за образование химической связи между сорбатом и сорбентом. Учитывая селективность сорбции, разделение в аффинной хроматографии часто реализуется по простейшей схеме динамической сорбции 1юглощение целевого биологически активного вещества на колонке с удалением в фильтрат несорбируе-мых примесей и его последующее элюирование в виде единственного хроматографического пика. Подобная схема оказывается наиболее удобной при решении препаративных задач. [c.201]

Плазматические мембраны лимфоцитов (содержащие 20 мг общего белка) экстрагировали 5 мл 1%-ного дезоксихолата, после чего растворимую фракцию (содержащую 85% мембранного белка) фильтровали через колонку с аффинным сорбентом. При элюировании 1 % -ным раствором дезоксихолата до нулевой базовой линии (при 280 нм) отмывали примерно 75% сорбированного белка. Рецепторные гликопротеины (составляющие 5% от фракции мембранных белков) элюировали раствором метил-а-D-глюкоииранозида (20 мг/мл) в 1%-ном дезоксихолате. Элюат подкисляли 2%-ной уксусной кислотой (добавляя 0,1 объема элюата), выпавший осадок промывали тремя порциями по 10 мл 95%-ного этанола для удаления моносахарида и дезоксихолата, а затем высушивали в токе воздуха. По данным электрофореза в акрил амидном геле (в присутствии 0,1%-ного додецилсуль-фата натрия) полученный препарат содержал пять компонентов. [c.454]

Однако наиболее важным и самым распространенным методом выделения и анализа ферментов является хроматография. Об этом можно судить по множеству публикаций и специальных обзоров, посвященных различным аспектам хроматографии ферментов. (См. обзор по колоночной хроматографии [20 и табл. 36.1.) В последние годы получили дальнейшее развитие новые высоко избиратетгьные методы выделения, такие, как аффинная хроматография [21—26 и гл. 7, 14], хроматография на гидроксиапатите [27 и гл. 35], хроматография на геле фосфата кальция [28 и гл. 35], гель-хроматография в градиенте детергента как метод очистки мембраносвязанных ферментов [29, 30], гель-проникающая хроматография [31 и гл. 5, 12], электрохроматог-рафические методы [11], ионообменная хроматография [32, 33 и гл. 6, 13], субетрат-специфичное элюирование [34]. [c.9]

Данная глава посвящена выделению хроматографическими методами интактных клеток и субклеточных частиц. Многие исследователи выделяют вирусы и субклеточные частицы хроматографированием на пористых стеклах, гелях, ионитах для фракционирования клеток чаще всего пользуются пористыми стеклами. Очевидно, наиболее перспективным в этом отношении методом следует считать аффинную хроматографию. Действительно, фракционирование клеток на хроматографических носителях, так называемая хроматография сцепления (adheren e), имеет много общего с аффинной хроматографией. Клетки определенного типа вначале более или менее избирательно сорбируют на носителе, а затем после удаления сопутствующих примесей элюируют подходящим элюентом. Однако на практике вторую стадию часто опускают и проводят элюирование путем экстракции в статических условиях. И наоборот, многие операции, проводимые в статических условиях, можно выполнять на хроматографических колонках. Именно по этой причине чрезвычайно трудно провести четкую границу между строго хроматографическими методами и элюированием в статических условиях. [c.309]

B для аффинной хроматографии антител типа IgG и антигенов. Белок А (мол. масса 42 ООО, выделен из Staphylo o us aureus) иммобилизован на поперечносшитом агарозном геле (см. разд. 30) бромциановым методом. Белок специфически взаимодействует с молекулами иммуноглобулинов IgG некоторых подтипов. Так как взаимодействие белка А с IgG не затрагивает у последних той части молекулы, посредством которой связываются антитела, возникает возможность выделения и очистки антигенов на БСС с адсорбированным IgG соответствующего типа. Элюирование комплекса антиген антитело выполняют с помощью 3 М раствора изотиоцианата калия. [c.227]

Наиболее часто используемый метод количественной аффинной хроматографии основан на элюировании биологических макромолекул с аффинной матрицы растворами аффинантов в различных концентрациях [7]. [c.45]

Объем элюирования макромолекулярного вещества прямо пропорционален концентрации аффинного лиганда, связанного с нерастворимым носителем, если концентрация растворимого аффинного лиганда постоянна. Кроме того, он обратно пропорционален концентрации растворимого аффинанта, если концентрация иммобилизованного аффинанта постоянна. Эти зависимости выражаются уравнением [c.45]

Против уравнений, выведенных Данном и Чейкеном [6], Николь и др. [12] высказали возражения. Данн и Чейкен [7] ограничились случаями, когда [Е]//Сь мало, т. е. используется очень низкая концентрация фермента. Другое ограничение касается взаимодействий со слишком низкими Кь- Например, если константа связывания равна 10 моль/л, то рассчитанная константа скорости диссоциации комплекса ЕЬ должна быть очень мала ( 0,042 С ) [7]. Следовательно, элюирование белка должно зависеть от кинетических факторов и не может быть проведено за реальное время опыта. Добавление растворимого лиганда к раствору элюента не должно оказывать влияния на элюирование белка, поскольку диссоциация — мономолекулярный процесс. Такими кинетическими эффектами объясняются наблюдаемые иногда неудачи при элюировании некоторых ферментов с аффинных сорбентов буферными растворами, содержащими сильные ингибиторы. В некоторых случаях белковый ник настолько уширяется, что его нельзя обнаружить. Метод пригоден главным образом для случаев, когда доступны сорбенты, содержащие лиганды со средней силой связывания. В таких случаях система полностью обратима в пределах времени проведения хроматографического опыта. [c.49]

МНг-сфероне проводилась в оптимальных условиях, взятых из данных, приведенных на рис. 3.1. Для элюирования использовались растворы антилпзина в различных концентрациях. Концентрация иммобилизованного аффинного лиганда [L], определенная исходя из эффективной емкости колонки, составила 2,6-10 моль/л. Свободный объем V-m, найденный с помощью декстрана 2000, равен 2,1 мл. Константа диссоциации комплекса химотрипсина с [c.50]

Анализ кривых элюир.ования макромолекул, специфически сорбируемых на аффинном сорбенте, является потенциальным аналитическим методом для изучения специфических взаимодействий биополимеров. Кривые элюирования очень близки к изотермам связывания элюируемого вещества с иммобилизованным аффинантом, и, следовательно, из хроматограммы можно получить термодинамические параметры молекулярных взаимодействий. Метод эквивалентен повторяющемуся диа-лизу и имеет много преимуществ по сравнению с обычным равновесным диализом. Например, он требует намного более низких концентраций и небольших количеств образца, несколько образцов разных молекул можно наносить одновременно и обнаруживать небольшие различия в связывающих способностях при хорошем разделении. [c.55]

Связываемость отражает меру силы взаимодействия фермента с иммобилизованным нуклеотидом и соответствует концентрации (ммоль/л) КС1 в центре пика фермента при элюировании фермента линейным градиентом концентрации K 1. На колонку (50X5 мм), содер-жащую 1 г аффинного сорбента, наносили 5 Е фермента. I — 1,5 мкмоль/мл АМР, II — 6,0 мкмоль/мл АМР. [c.60]

Аффинный сорбент А, приготовленный путем привязки ингибитора — л-аминофенил-р- о -тиогалактопиранозы — непосредственно к сефарозе, не связывает и не задерживает фермент в заметной степени. Прикрепление ингибитора через короткую ножку (- 10 А) дает сорбент Б, который очень мало задерживает фермент во время его пропускания через колонку. Для освобождения фермента из комплекса нет необходимости в изменении состава буферного раствора, п фермент выходит из колонки сразу же за неактивным белком. Только когда между ингибитором и поверхностью носителя помещена длинная ножка ( -21 А), образующийся сорбент В способен сильно связывать р-галак-тозидазу из различных бактериальных источников. Элюирование фермента происходит только после замены буферного раствора. Этот сорбент часто приводится в качестве примера очень эффективного специфического сорбента, приготовленного из ингибитора с относительно высокой константой ингибирования (5-10 моль/л) при относительно низкой концентрации аффинанта (0,6 ммоль/л). О Карра и др. [26] приготовили сорбенты, ана- [c.71]

Другим примером влияния концентрации аффинного лиганда является аффинная хроматография смеси лактатдегидрогеназы и сывороточного альбумина на N -(6-аминогексил)-5 -АМР — сефарозе [8]. При высоких концентрациях лиганда (1,5 мкмоль 5 -АМР в 1 мл) для элюирования с )ермента необходимо введение NADH ( удар ). При низких концентрациях (0,125 мкмоль 5 -АМР в 1 мл) десорбция фермента достигается просто градиентом концентрации (от О до 1 моль/л) хлорида калия. Дальнейшее уменьшение количества прикрепленного лиганда (0,025 мкмоль 5 -АМР в 1 мл) приводит к прогрессивному увеличению доли лактатдегидрогеназы, элюируемой исходным уравновешивающим буфером даже перед наложением линейного градиента солей. В то же время [c.75]

Изменения аффинности и емкости Р -(6-аминогексил)-Р -(5 -аденозин) пирофосфат — сефарозы при разбавлении разными количествами немодифицированной сефарозы на примере взаимодействия с миокиназой хорошо видны в табл. 5.2 [8]. Разбавление аффинным сорбентом ведет к уменьшению связываемости р, выраженной через концсптрацпн хлорида калия, которые необходимы для элюирования фермента. Емкость сорбента, выраженная в единицах активности фермента, сорбированного па 1 мкмоль нуклеотида, возрастает при низких концентрациях нуклеотида, хотя абсолютная емкость на 1 г материала колонки с разбавлением уменьшается. [c.78]

Геометрия колонок, концентрация и общее содержание аффинного лиганда — вот три основных параметра, которые определяют и связываемость, и емкость носителя. Для систем с высокой аффинностью высота колонки с аффинным сорбентом, содержащим высокие концентрации лиганда, мало влияет связываемость зависит от концентрации аффинанта, а не от высоты колонки. Это имеет практическое значение колонки, содержащие высокие концентрации лиганда, можно использовать для концентрирования разбавленных растворов ферментов. Кроме того, в системах с высокой аффинностью, в которых элюирование адсорбированных макромолекул без денатурации затруднено, разбавление аффинного сорбента немодифицированным гелем или уменьшение концентрации лиганда может способствовать элюированию в более мягких условиях. В некоторых случаях, конечно, фермент различает только концентрацию лиганда в гранулах модифицированного геля, которая, однако, не меняется при разбавлении. В таких случаях трудности элюирования остаются даже после разбавления геля [11]. Для взаимодействий систем с низкой аффинностью очень важна геометрия колонки. Для разделения специфически адсорбированных белков от неадсорбированных наиболее выгодно использовать длинные колонки, а не короткие. [c.80]

Из сопоставления ВЭТТ можно сделать важные практические выводы, а именно найти аффинный сорбент, характеризующийся не только хорошей связываемостью, но и лучшей избирательностью. Очевидно, таким образом Олсон и др. [28] обнаружили, что необходимо прекратить поток раствора в колонке за несколько часов перед специфическим элюированием. Время уравновешивания не влияет на связываемость лактатдегидрогеназы на иммобилизованном NAD+ или на связываемость глицерокиназы на иммобилизованном АТР, если перед элюированием ферменты в течение 1,5 и 20 ч соответственно оставлять в контакте с иммобилизованными нуклеотидами [19]. Этот факт можно использовать для хранения ферментов, устойчивость которых зависит от присутствия субстратов или кофакторов. [c.83]

Бесконкурентное действие. Если устойчивость тройного комплекса ЕЫ выше, чем двойного Е1, то присутствие свободного ингибитора I уменьшает долю фермента в подвижной фазе и повышает связываемость фермента. Если тройной комплекс ЕЫ менее устойчив, чем двойной ЕЬ, увеличение концентрации свободного аффинного лиганда приведет к элюированию фермента. [c.92]

Таким образом, многие факторы влияют на взаимодействие иммобилизованного лиганда с комплементарной молекулой. Как биоспецифическая, так и небиоспецифическая сорбция основана по сути дела на тех же электростатических и гидрофобных взаимодействиях и их комбинации. Вклад небиоспецифических взаимодействий можно лучше оценить, сопоставляя константы диссоциации комплекса выделяемой макромолекулы с иммобилизованным аффинным лигандом и с тем же лигандом в растворе, используемом для элюирования (гл. 4). Такая характеристика аффинной системы весьма необходима, особенно если аффинная [c.101]