Вирусы в качестве векторов геномы

Книга охватывает все таксоны бактерий и посвящена проблемам теоретической и прикладной бактериологии. Поскольку в природе преобладают сапрофитные формы, паразитические и патогенные бактерии отдельно не рассматриваются. Не обсуждаются также специальные методы прикладных областей микробиологии, равно как и не делается попытка охватить всю микробиологию. Вирусы упоминаются только в связи с бактериофагами, используемыми в качестве векторов в процессе переноса генов, водоросли — только в связи с цианобактериями (сине-зелеными водорослями) дрожжи, плесневые грибы и простейшие упоминаются лишь вскользь. [c.7]

Рис. 9.5. Геном вируса лейкоза мышей Молоки-ретровируса (РНК-вирус, содержащий ген фермента обратной транскриптазы), ДНК-тран-скрипт которого встраивается в геном млекопитающего и может использоваться в качестве вектора для переноса генов млекопитающих в клетку [2296].

Принцип действия клеточного дисплея заключается в экспрессии на поверхности клеток гетерологичных белков (белков-пассажиров), которые отсутствуют у данного организма, объединенных в составе гибридной молекулы с помощью пептидного спейсера с полипептидной цепью белка-носителя, обеспечивающего заякоривание всей конструкции в мембране клеток. При этом используют гибридные белки трех типов, в которых белок-пассажир находится на N-конце, С-конце или во внутренней части белка-носителя в виде сэндвича. Для успешного выполнения своих функций белки-носители должны отвечать, по крайней мере, четырем требованиям 1) обладать эффективной сигнальной или транспортной последовательностью, обеспечивающей прохождение гибридного белка через внутренние мембраны клеток 2) проявлять сильные якорные свойства для прочного удерживания белка-пассажира на поверхности клеток 3) должны быть совместимыми с белками-пассажирами, т.е. не дестабилизироваться после объединения с ними 4) демонстрировать устойчивость к протеолитическим ферментам, присутствующим в периплазматическом пространстве или культуральной жидкости. В качестве векторов для генов гибридных белков используют экспрессирующие плазмиды или хромосомы вирусов. [c.350]

Несомненно, что при создании живых поливалентных вакцин в качестве векторов наиболее целесообразно использовать вирусы, уже применяемые как живые вакцины. При этом, как показали опыты, генно-инженерные манипуляции без особых проблем можно осуществлять лишь на крупных ДНК-содержащих вирусах, так как размер их генома не имеет строгих ограничений при упаковке в вирион и поэтому допустима встройка в такую вирусную ДНК от одного до нескольких чужеродных генов. [c.437]

Полученный целевой ген с помощью ферментов лигаз сшивают с другим геном, который используется в качестве вектора для встраивания гибридного гена в клетку. В качестве вектора могут служить плазмиды, бактериофаги, вирусы человека, животных и растений. [c.99]

В случае использования в качестве векторов вирусов человека, животных и растений чужеродный ген встраивают в ДНК вируса, и он реплицируется вместе с размножением последнего в клетке. Применяют в качестве вектора космиды, представляющие собой гибрид плазмиды с фагом. Космиды используются для клонирования больших (до 45 тыс. пар нуклеотидов) фрагментов ДНК эукариот. [c.99]

Важное свойство векторов на основе ВРУ-1 состоит в том, что они практически являются плазмидами морфологически трансформируемых ими эукариотических клеток и в их составе можно клонировать крупные фрагменты ДНК. В целом использование вируса папилломы быка в качестве молекулярного вектора, несомненно, полезно и дополняет систему клонирования и изучения функционирования генов в различных клетках млекопитающих. [c.371]

Впервые возможность переноса ДНК при помощи микроинъекций в пронуклеус оплодотворенной яйцеклетки мыщи была проиллюстрирована Дж. Гордоном и др. В этом эксперименте в несколько сотен оплодотворенных яйцеклеток инъецировали плазмидный вектор pBR322, содержащий ген тимидинкиназы вируса простого герпеса (HSV) и часть генома обезьяньего вируса 40 (SV40). Из 78 потомков, рожденных приемными матерями, два содержали плазмидную ДНК. Авторы сделали вывод, что эти данные свидетельствуют о возможности использования рекомбинантных плазмид в качестве вектора для введения чужеродных генов непосредственно в эмбрионы мыщей, которые сохраняют эти гены в ходе развития . К сожалению, плаз- [c.428]

Исследуются и возможности использования ДНК для лечения наследственных заболеваний. В настоящее время усилия в этой области направлены на встраивание ДНК нормальных генов в соматические клетки, такие, как клетки костного мозга (генная терапия). В последние годы осуществляются эксперименты in vitro и на животных, где в качестве векторов для введения генов используются ретровирусы. До весны 1985 года такие исследования на людях не проводились. Более ранние попытки осуществления генной терапии для лечения аргининемии с использованием вируса папилломы Шоупа и Р-талассемии с использованием Р-глобиновых генов были преждевременными и не дали клинического эффекта. Применение генной терапии половых клеток, то есть встраивание нормальных генов в дефектные половые клетки, оплодотворенные яйцеклетки или эмбрионы [c.33]

Следует учитывать две основные особенности маркерных генов. Во-первых, их структуру (нуклеотидную последовательность), которая определяет такие факторы, как регуляция транскрипции (конститутивная экспрессия или включение под действием определенных внешних условий или стадии развития), скорость транскрипции, стабильность транскрипта и эффективность трансляции. Во-вторых, активность продукта данного гена, который, очевидно, отвечает за доминантную экспрессию подходящего селективного фенотипа. В большинстве обычных векторов трансформации в качестве селективных маркеров используют прокариотические ферменты устойчивости к антибиотикам, которые были адаптированы с помощью генно-инженерных методов для конститутивного синтеза в растительных клетках (табл. 2.1). В некоторых экспериментах в качестве доминантных маркеров успешно использовались ферменты, обеспечивающие защиту от гербицидов. Обычно добиваются слияния кодирующей последовательности фермента с промоторами, выделенными из Т-ДНК или генома вируса мозаики цветной капусты (ВМЦК), на 5 -конце, а на З -конце —с сигналом полиаденилирования (тоже полученным, как правило, из какого-либо гена Т-ДНК). В качестве маркерных генов наиболее широко используют гены устойчивости к таким антибиотикам, как канамицин, G418 [8, 27], гигромицин [54] и блеомицин [28] Недавно для трансформации растительных клеток в качестве доминантных маркеров были попользованы гены, обеспечивающие устойчивость к гербицидам, таким, как глифосат [45]. Поскольку селективные маркерные гены нормально функционируют в трансформированных [c.33]

Вирус осповакцины привлекателен в качестве вектора по нескольким причинам. Во-первых, у него широкий спектр клеток-хозяев (от позвоночных до беспозвоночных). Во-вторых, его большой геном (187 т.п.н.) позволяет внедрять фрагменты чужДНК размером до 25 т п.н. В-третьих, его безопасность подтверждена [c.400]

Еще одним подходом, дающим надежду на увеличение эффективности переноса генов, является использование в качестве векторов ретровирусов. Основное преимущество этих векторов заключается в том, что они способны эффективно инфицировать большое число различных клеточных типов. Общий вид вирусного вектора, используемого для трансгеноза, изображен на рис. 66. Ретровирусные векторы обеспечивают интеграцию единичной копии трансгена в эмбрионы на разных стадиях развития. Первые эксперименты, продемонстрировавшие внедрение и наследование у мышей экзогенно введенного мышиного вируса лейкемии Молони (MoMLTV), были проведены еще в середине 70-х годов прошлого века Енишем с сотрудниками [c.191]

Для получения линий иммортализованных фибробластов человека были выбраны два варианта воздействия онкогенного вируса SV40 на нормальные клетки tsA мутантом вируса и вектором pSVSneo, содержащим последовательность ДНК, кодирующую ранние белки вируса SV40, в том числе большой Т-антиген, а также бактериальный ген neo в качестве селективного маркера. [c.267]

В последние годы в качестве безопасного вектора активно изучают штамм вируса осповакцины MVA, полученный германскими учеными в результате множественных пассажей VA на куриных эмбрионах в 1970-х гг. Штамм MVA является высокоаттенуированным вариантом вируса осповакцины, он способен in vitro размножаться на культурах клеток птиц, но практически не размножается в клетках млекопитающих. Тем не менее при вакцинации экспериментальных животных или людей рекомбинантными вариантами VA штамма MVA наблюдается эффективный иммунный ответ против целевых белков, чьи гены встроены в вирусный геном. Получаемые рекомбинантные MVA не вызывают побочных реакций при введении экспериментальным животным в очень высоких дозах. Предполагается, что VA штамма MVA можно будет использовать в качестве вектора для вакцинации даже иммунодефицитных людей. [c.395]

Большинство работ по созданию живых вирусных вакцин проводились на ВКО, однако в качестве кандидатов на роль векторов для вакцинации рассматриваются и другие вирусы аденовирус, полиовирус и вирус ветряной оспы. Вектор на основе живого аттенуированного полиовируса (его исследования только начинаются) привлекателен тем, что позволяет проводить пероральную вакцинацию. Такие слизистые вакцины (вакцины, компоненты которых связываются с рецепторами, расположенными в легюгх или желудочно-кишеч-ном тракте) пригодны для профилактики самьгх разных заболеваний холеры, брюшного тифа, фиппа, пневмонии, мононуклеоза, бешенства, СПИДа, болезни Лайма. Но до любых клинических испытаний любого на первый взгляд безобидного вируса как системы доставки и экспрессии соответствуюхцего гена необходимо убедиться в том, что он действительно безопасен. Например, повсеместно используемый ВКО вызывает у людей осложнения с частотой примерно 3,0-10 . Поэтому из генома рекомбинантного вируса, который предполагается использовать для вакцинации человека, желательно удалить последовательности, ответственные за вирулентность. [c.242]

Вопрос о применении геной терапии всегда вызывал споры, но большинство ученых согласны с Т. Фридманом и Р. Роблином, которые еще в 1972 г. (S ien e 175 949-955) писали Мы считаем, что геная терапия сможет облегчить симптомы некоторых наследственных заболеваний человека, поэтому необходимо продолжать исследования, направленные на ее развитие. Ключевые моменты генной терапии — адресная доставка терапевтического гена и обеспечение его экспрессии в определенных клетках или тканях. Сначала в качестве основного средства доставки терапевтических генов рассматривали векторы, полученные на основе вирусов человека. Это было связано с наличием у них механизмов проникновения в специфические foieTKH. Наиболее многообещающими считали векторы на основе ретровирусов. Но нативный ретровирус - это инфекционный агент, который по- [c.492]

В случае простейшего ретровирусного вектора транс-дейст-вующие вирусные структурные гены удаляют и на их место встраивают один или несколько рестрикционных сайтов для клонирования. Известно несколько векторов этого типа (см., например, [18, 19]). В качестве примера вектора, рассчитанного на клонирование одиночных генов, можно назвать вектор на основе вируса лейкоза мышей Молони (Mo-MLV), обозначаемый рМХ1112 (рис. 9.3, а). В этой конструкции полилинкер содержащий множественные рестрикционные сайты для клонирования, введен на место удаленных вирусных генов gag, pol и env. Клонированный в данном векторе чужеродный ген эффективно экспрессируется благодаря промотору в составе вирусного 5 -LTR, а наличие ч с-действующих вирусных последовательностей позволяет этой системе формировать инфекционные части- [c.279]

Молекулярные клонирующие векторы играют ключевую роль в постановке генно-инженерных экспериментов на выбранной системе клеток. В системе клеток прокариот и низших эукариот в качестве векторных молекул используют плазмиды или ДНК вирусов. В культивируемых клетках млекопитающих эндогенные плазмиды не найдены, поэтому внимание исследователей сконцентрировалось на ДНК-со-держащих вирусах. К моменту появления генно-инженерной методологии наиболее хорошо изученным в генетическом и биохимическом плане был вирус SV40. Имелись методы наработки и очистки данного вируса, выделения его ДНК и трансфекщ1и ею чувствительных культур клеток. Поэтому именно на основе ДНК вируса SV40 бьши созданы первые клонирующие векторы культивируемых клеток млекопитающих. [c.354]

Использовать в качестве молекулярного вектора герпесвирус кошек (FHV) попытались Г. Коль с соавторами (1990 г.). В ген тимидинкиназы FHV рекомбинационно встраивали либо ген env, либо ген gag вируса лейкемии кошек (FeLV), объединенный с ранним промотором цитомегаловируса человека. Клетки, инфицированные гибридными вариантами FHV, продуцировали соответствующие чужеродные белки. Заражение кошек гибридами приводило к формированию в их организме иммунного ответа на синтезируемые белки FeLV. Таким образом, герпесвирус юшек можно рассматривать как основу для создания живых поливалентных вакцин против ряда инфекционных заболеваний этих животных. [c.388]

Данные эксперименты натолкнули исследователей на мысль об использовании определенных сегментов вирусного генома в качестве ам-плифицирующих вирусных векторов. Прежде всего была изучена возможность введения в дефектный геном вируса чужеродной ДНК. Р Спет и Н. Френкель (1982 г.) встроили по Bgal-участку плазмиды рКС7 (производная [c.388]

Следует отметить, что инактивация в результате встройки целевых генов таких локусов VA , как гены тимидинкиназы, гемагглютинина и др., приводит к снижению вирулентных свойств вируса. Поэтому гибридные VA в большинстве случаев должны быть аттенуированными по отношению к исходному вирусу. Данному вопросу уделяется большое внимание, прорабатываются и различные альтернативные варианты. Так, в 1992 г. в лаборатории Э. Пэолетти предложили использовать в качестве молекулярного вектора при создании живых поливалентных вакцин вирус оспы канареек, который не реплицируется в клетках млекопитающих, но обеспечивает после вакцинации экспрессию целевых генов и иммунный ответ на их белковые продукты. [c.395]

Ретровирусы обладают рядом уникальных свойств, что обусловило активное использование их в последние годы в качестве молекулярных векторов. Относительно небольшой геном ретровирусов позволяет довольно просто с ним манипулировать и вводить в его состав чужеродные гены. При этом нет жестких ограничений на размер генома, упаковываемого в вирион, и поэтому удается встраивать экзогенные фрагменты ДНК длиной до 10 тпн. Ретровирусная инфекция обычно приводит к стабильной интеграции единственной копии вирусного генома в ДНК клетки-хозяина. Данные вирусы можно легко нарастить в кулыуре клеток до высокого титра. Ретровирусы способны инфицировать как эмбрионы, так и кроветворные клетки, причем эффективность инфицирования очень велика и достигает в эксперименте практически 100 %. Ретровирусы содержат мощные усилители транскрипции, которые обеспечивают высокий 5фОвень экспрессии клонированных генов в клетках различных типов. [c.400]

Смотреть страницы где упоминается термин Вирусы в качестве векторов геномы: [c.301] [c.500] [c.441] [c.54] [c.240] [c.328] [c.202] [c.171] [c.73] [c.177] [c.359] [c.363] [c.418] [c.259] [c.214] [c.126] [c.141] [c.397] [c.336] [c.293] [c.342] [c.405] [c.416] [c.359] [c.92] [c.8] [c.359] [c.390] [c.405]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология