Органеллы, очистка

Современное состояние наших знаний в этой области достигнуто благодаря использованию целого ряда экспериментальных подходов. К ним относятся 1) применение более совершенного спектроскопического оборудования для измерения содержания переносчиков (НАД, флавопротеидов, цитохромов) и кинетики их восстановления и окисления в разнообразных дыхательных органеллах 2) использование разнообразных методов, позво-ляюш их удалять из митохондрии ферменты, участвующие в окислении субстратов, окислительном фосфорилировании и других реакциях, связанных с дыханием, с тем чтобы можно было исследовать лишь те реакции, которые ответственны за перенос электронов 3) дальнейшее дробление митохондрий и дыхательных субчастиц для получения комплексов дыхательных ферментов, свободных от структурных белков эти комплексы можно подвергать дальнейшей очистке для получения гомогенных препаратов и исследования свойств, функций и взаимосвязи их компонентов 4) воссоздание цепи переноса электронов с использованием вышеупомянутых препаратов совместно с растворимыми ферментами 5) использование ингибиторов дыхания. [c.389]

Биохимический анализ часто сопряжен с разрущением тонкой структуры клеток. Однако в настоящее время разработаны методы мягкого фракционирования клеточного содержимого, целью которых является сохранение функции различных клеточных компонентов. Подобно тому как ткань можно разделить на составляющие клетки различных типов, клетки можно разделить на ее функциональные органеллы и макромолекулы. В этом разделе мы сосредоточим внимание на методах, позволяющих проводить очистку органелл и белков Родственные методы мечения макромолекул радиоизотопами и антителами, равно как и чрезвычайно эффективные методы анализа ДНК и функции генов, обсуждаются в последующих разделах. [c.208]

Следует подчеркнуть, что препаративные типы центрифуг применяют для получения и очистки клеточных органелл или макромолекул, т. е. чистых фракций (препаратов). Аналитические цент- [c.219]

Обработка загрязненных осадков органелл ДНКазой I несомненно способствует более полной очистке хлоропластной и митохондриальной ДНК от примесей ядерной ДНК и позволяет получать препараты с большей мол. массой. Однако процедуру обработки ДНКазой I можно и опустить, если есть подозрения, что на этой стадии происходят значительные потери материала. [c.261]

Выделение биомолекул. Как и в случае органелл, для выяснения функции любой биомолекулы необходимо прежде всего получить ее в чистом виде. В табл. 2.5 перечислены основные методы, используемые для разделения и очистки биомолекул. Здесь мы не будем подробно обсуждать их некоторые из них будут вкратце описаны в других частях кни и. [c.16]

При использовании большинства методов выделения ДНК из тканей животных происходит одновременное выделение геномной и митохондриальной ДНК. Последняя, как правило, присутствует в клетках в виде множественных копий, что приводит к высокой представленности митохондриальных генов в полученных препаратах ДНК и в клонотеках, создаваемых на основе этих препаратов. В случае необходимости, для освобождения от митохондриальной ДНК на первых стадиях очистки геномной ДНК получают ядра клеток анализируемых тканей. Альтернативно, при необходимости выделения чистой митохондриальной ДНК вначале получают эти органеллы [65]. [c.41]

Виды ультрацентрифуг. Все отечественные и зарубежные ультрацентрифуги можно разделить на два типа аналитические и препаративные. Аналитические центрифуги позволяют анализировать распределение вещества в пробирке в течение всего времени. Препаративные, как правило, используются для получения и очистки клеточных органелл и макромолекул, т. е. для получения чистых фракций, препаратов (отсюда название—препаративная). Для беспрерывного наблюдения аналитические центрифуги снабжены оптической системой. При работе на препаративных центрифугах применяют фракционирование содержимого центрифужной пробирки с тем, чтобы в каж- [c.104]

Эти методы служат для разрушения клеток и выделения ферментов в раствор. Если фермент локализован в органеллах, метод может быть использован только при условии, что органеллы также разрушаются. С другой стороны, может понадобиться предварительное выделение самих органелл, что позволит избавиться от загрязнения цитоплазматическими ферментами перед экстракцией фермента из органелл. Для этого требуется менее сильное воздействие. Предварительное растворение поверхностных коллагеновых и целлюлозных структур препаратами гидролитических ферментов позволяет в дальнейшем разрушать клетки более мягкими способами, сохраняя целостность органелл. Примером подобной методики служит получение препаратов митохондрий из таких тканей, как скелетная или сердечная мышцы, под действием протеолитических ферментов [6]. Однако эта методика применима только для получения препаратов в небольших масштабах и больше подходит для. метаболических исследований органелл, чем для очистки ферментов. Выход очищенных органелл может быть очень низким, поэтому во многих случаях лучше сначала разрушить всю ткань, а затем уже приступить к выделению нужного фермента из сложной смеси белков в экстракте. Таким образом, ферменты митохондрий и хлоропластов часто получают из тканевого гомогената, а не из выделенных органелл. [c.42]

В этом разделе кратко рассматриваются методы работы, используемые для выделения ферментов, структурно связанных с нерастворимыми компонентами клетки, такими, как митохондрии, хлоропласты, плазмалемма, эндоплазматический ретикулум и ядерные мембраны. Эти методы не применяются к водорастворимым ферментам, заключенным внутри органелл, например к белкам митохондриального матрикса, а лишь к ферментам, ковалентно связанным или прочно ассоциированным с частицами. Существенной степени очистки по сравнению с исходным материалом можно добиться, многократно промывая гомогенат буфером, в котором данный фермент не растворяется. После этого возможны два подхода к решению проблемы. Можно фракционировать осадок методом дифференциального центрифугирования (седиментация или градиент плотности), с помощью электрофореза или молекулярных сит . [c.52]

В этой части рассмотрены принципы, которые лежат в основе разделения клеточных органелл и частиц (центрифугирование) и способы их очистки (хроматография и электрофорез). Некоторые из этих методов применяются в основном при препаративном разделении, другие с успехом используются в аналитических целях. В приложении даны рекомендации по выбору того или иного метода разделения. [c.42]

Всякому структурному исследованию ДНК или РНК предшествуют выделение их из клеток, очистка и фракционирование. Поскольку в клетке нуклеиновые кислоты практически всегда находятся в комплексес белками (т. е. в вил, нуклеопротеидов), их выделение сводится в основном к очистке от белков (депротеинизации). Чаще всего нуклеиновые кислоты экстрагируют из гомогенатов клеток или очищенных клеточных органелл смесью фенол — вода В присутствии ионных детергентов (например, додецилсульфата натрия). При этом белки (и ряд других клеточных компонентов) переходят в органическую фазу, а нуклеиновая кислота остается в водной фазе. Из водного раствора ДНК или РНК осаждают спиртом. [c.10]

Выделение. Одии из первых этапов выделения Б,-получение соответствующих органелл (рибосом, митохондрий, ядер, цитоплазматич. мембраны) с помощью дифференциального центрифугирования. Далее Ь переводят в растворимое состояние путем экстракции буферными р-рами солей и детергентов, иногда-неполярными р-рителями. Затем применяют фракционное осаждение неорг. солями [обычно (N 14)2804], этанолом, ацетоном или путем изменения pH, ионной силы, т-ры. Для предотвращения денатурации работу проводят при пониж. т-ре (ок. 4°С) с целью исключения протеолиза используют ингибиторы протеаз, нек-рые Б. стабилизируют полиоламн, иапр. глицерином. Дальнейшую очистку проводят по схемам, специально разработанным для отдельных Б. илн группы гомологичных Б. Наиб, распространенные методы разделения-гель-про-никающая хроматография, ионообменная и адсорбц. хроматография эффективные методы-жидкостная хроматография высокого разрешения и аффинная хроматография. [c.250]

Кровь представляет собой вязкую жидкость красного цвета со средней плотностью р = 1,057 г/см . Кровь состоит из межклеточного вещества — плазмы крови и взвешенных в ней форменных элементов эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов (рис. 1). Эритроциты человека представляют собой безъядерные клетки, утратившие в процессе фило— и онтогенеза ядро и большинство органелл, в том числе и митохондрии, и поэтому для молекулярно-генетического анализа эритроциты не представляют интереса. Тем не менее, содержащийся в них гемоглобин и продукты его деструкции, вплоть до гемина, в присутствии молекулярного кислорода, являются потенциальными центрами радикалообразо-вания и ингибиторами Тад-полимеразы. Поэтому при выделении ДНК из крови необходимо большое внимание уделять степени очистки проб от геминовых дериватов. [c.83]

Ознакомившись достаточно подробно с используемой техникой, перейдем к рассмотрению основных методов ультрацентрифугирования, применяемых для очистки и фракционирования белков, нуклеиновых кислот и субклеточных органелл дифференциального, зонально-скоростного и равновесного (изопикни-ческого). Они будут рассмотрены в этом же порядке. Под частицами будем, как и прежде, понимать не только молекулярные агрегаты, но и макромолекулы. [c.199]

Перколл применяют лишь для очистки клеток и достаточно крупных клеточных органелл, осуществляемой обычно в режиме равновесного центрифугирования. [c.208]

Грубые гомогенаты, содержащие органеллы или их фрагменты, можно фракционировать с помощью дифференциального центрифугирования, при котором величина возрастает на. каждой ступени, и это приводит к последовательному осаждению частиц с постепенно уменьшающейся величиной г (р—ро). Такое дифференциальное центрифугирование является первым этапом очистки органелл от различных тканей при условии, что> нужный фермент находится не в растворимой фракции, а в ор-ганеллах. [c.17]

К числу недостатков ферментативного метода получення протопластов можно отнести 1) невозможность применения этого метода для некоторых видов 2) необходимость затрачивать дополнительное время На выделение протопластов (что отнюдь не ограничивает возможность применення этого метода в тех случаях, когда гарантированные результаты оправдывают затраченные усилия) н 3) ограниченный выход органелл (1—5 мгХл на 10 г ткани листа). Сюда же относится и настоятельная необходимость проводить переваривание в теченне минимального времени и использовать для очистки протопластов наиболее подходящий способ. Следует помнить о том, что переваривающие, ферменты могут подавляться различного рода ингибито рам и, а сама обработка ферментами может давать ряд побочных эффектов. [c.557]

Митохондрии выделяли с помощью дифференциального центрифугирования (Войников, 1980). Очистку органелл проводили в ступенчатом градиенте перколла, состоящем из 18, 23, 35% перколла (Войников и др., 1991). [c.8]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология