Белки седиментация в ультрацентрифуг

Установлено, что белки могут иметь весьма различные размеры и форму. Определение молекулярной массы и размеров молекул белка выполняется с применением мощного арсенала физических методов исследований. Молекулярные массы можно определить с помощью измерения скоростей диффузии, скоростей седиментации в ультрацентрифуге, рассеяния света и даже путем измерения размеров индивидуальных больших по размеру молекул белка методом электронной микроскопии. [c.510]

Для проведения седиментометрического анализа кинетически устойчивых систем (золей, растворов ВМВ) с целью определения размеров и массы их частиц недостаточно силы земного тяготения. Последнюю заменяют более значительной центробежной силой центрифуг и ультрацентрифуг. Идея этого метода принадлежит А. В. Думанскому (1912), который впервые применил центрифугу для осаждения коллоидных частиц. Затем Т. Сведберг разработал специальные центрифуги с огромным числом оборотов, названные ультрацентрифугами. В них развивается центробежная сила свыше 250 ООО Современная ультрацентрифуга представляет собой сложный аппарат, центральной частью которого является ротор (с частотой вращения 60 000 об/мин и выше), с тончайшей регулировкой температуры и оптической системой контроля за процессом осаждения. Кюветы для исследуемых растворов вмещают всего 0,5 мл раствора. В ультрацентрифуге оседают не только частицы тонкодисперсных золей, но и макромолекулы белков и других ВМВ, что позволяет производить определение их молекулярной массы и размеров частиц. Скорость седиментации частиц в ультрацентрифуге рассчитывают также по уравнению (23.9), заменяя в нем g на о) х, где (О — угловая скорость вращения ротора л — расстояние от частицы до оси вращения. [c.378]

Установлено, что белки могут иметь весьма различные размеры и форму. Определение молекулярных масс и размеров белков было выполнено с применением мощного арсенала физических методов исследований. Молекулярные массы можно определить с помощью анализа отдельных компонентов (см. упражнение 20-23), измерения скоростей диффузии, скоростей седиментации в ультрацентрифуге, рассеяния света и даже путем измерения размеров индивидуальных, очень больших по размеру молекул белка методом электронной микроскопии. Сведения о форме молекул получают, измеряя скорости молекулярной релаксации после электрической поляризации, исследуя изменения в оптических свойствах (двойное лучепреломление), возникающие в струе жидкости, непосредственно с помощью электронной микроскопии и, что имеет, быть может, наиболее важное значение, исследуя интенсивность рассеяния света и рентгеновского излучения как функцию угла рассеяния. Применение всех этих методов часто встречает трудности вследствие высокой степени гидратации белков, а также в результате того, что многие белки вступают в обратимые реакции ассоциации, образуя димеры, три-меры и т. д. Молекулярные массы, молекулярные параметры и изоэлектрические точки ряда важных белков приведены в табл. 20-2. [c.125]

Применение ультрацентрифуг, в которых ускорение в миллион раз превосходит ускорение силы тяжести, дало возможность изучить седиментацию белков и других высокомолекулярных соединений, а также вирусов. [c.319]

Препаративные ультрацентрифуги предназначены для выделения из растворов отдельных фракций. Конечно, эти фракции могут быть однородны только по одному показателю — по скорости седиментации, а по другим свойствам могут значительно отличаться. Например, гамма-глобулины человека (один из видов белков крови, широко известный в медицине как лечебное средство) при центрифугировании обычно разделяется на две фракции с константами седиментации 75 и 19S. Белки, образующие эти фракции, заметно различаются между собой и по ряду других свойств (иммунологическим свойствам, электрофоретической подвижности и т. п.). [c.148]

В опыте с яичным альбумином в буферном водном растворе (pH 6), проводимом в ультрацентрифуге, по изменению положения градиента показателя преломления во времени было определено, что граница передвигается на 6,3 мм за 105 мин. Скорость центрифуги составляет 57 000 об/мин. Расстояние от оси вращения равно 6,43 см. Показать, что коэффициент седиментации этого белка равен 3,5-10- с после умножения на 0,81 для введения поправки на плотность и вязкость. [c.624]

В ультрацентрифуге оседают не только мельчайшие частицы гидрофобных коллоидов, ио и молекулы белков и высокомолекулярных веществ. Скорость седиментации V сферических частиц в ультрацентрифуге определяется также [c.42]

Ультрацентрифуга, разработанная Сведбергом, развивает центробежную силу, превышающую приблизительно в 500 ООО раз силу земного притяжения. Центробежная сила пропорциональна радиусу вращения и квадрату скорости вращения. Если на белковый раствор воздействовать очень большой центробежной силой, то процесс седиментации белка будет протекать гораздо быстрее, чем процесс диффузии. Первоначально белковые молекулы равномерно распределены в растворителе, но под действием центробежной силы они удаляются от оси вращения и между водой и белковым раствором образуется довольно четкая граница. В области границы заметно изменяется показатель преломления, и это позволяет следить зг движением границы во время центрифугирования с помощью различных, специально сконструированных оптических систем. При исследовании однородных молекул наблюдается одна-единствен-ная граница. Если же присутствуют два белка и они достаточно различаются по размерам молекул, то образуются две границы. Скорость движения границы выражается формулой [c.15]

Наиболее точные данные о молекулярных весах белков получены при применении ультрацентрифуги, которая впервые была использована для этой цели Сведбергом и Никольсом в 1923 г. и позднее значительно усовершенствована. Этот метод основан на скорости седиментации (оседания) частиц под действием силы тяжести по величине этой скорости можно вычислить величину частиц и их молекулярный вес. Ультрацентрифуга вращается с очень большой скоростью (100 000 и более обо- [c.206]

Исследование в ультрацентрифуге. Форма, ширина и скорость расширения пика белка при седиментации в ультрацентрифуге позволяют судить о чистоте белкового препарата. Примеси обнаруживаются по возникновению дополнительных пиков, появлению плеч на главном нике, по асимметрии главного пика или по увеличению ширины пиков (в сравнении с их шириной, соответствующей коэффициенту диффузии чистого белка). Такие исследования желательно проводить при различных значениях pH и ионной силы. [c.83]

Оценка чистоты. — Шведские химики Сведберг и Тизелиус внесли большой вклад в развитие химии белка разработкой аналитических методов, чрезвычайно удобных для характеристики этих, высокомолекулярных соединений. Метод ультрацентрифугирования Сведберга служит для определения молекулярного веса. При вращении с очень большой скоростью ячейки, содержащей раствор белка, молекулы белка под действием центробежных сил движутся от центра со-скоростью, зависящей от величины молекулярного веса. Специальная оптическая система дает возможность наблюдать и фотографировать ячейку во время центрифугирования. Молекулярный вес может быть, найден либо из определения седиментационного равновесия, либо по-скорости седиментации- Хотя теоретически первый метод точнее, для достижения равновесия требуется длительное время, и поэтому более точные значения получают, исходя из определения скорости седиментации. При применении ультрацентрифуги можно установить также гомогенность молекул (по величине и форме). Тизелиус предложил (1937) электрофоретический метод разделения молекул белка в электрическом поле молекула белка движется со скоростью, определяющейся величиной молекулы, ее формой, количеством и типом ионизированных групп. Материал, кажущийся гомогенным по растворимости, может содержать компоненты, отличающиеся по электрофоретической подвижности. Жестким критерием чистоты является профиль кривой распределения, получаемой при противоточном распределении молекул (Крейг, см. 31.29). [c.674]

Седиментация в ультрацентрифуге является вторым методом, с помощью которого смесь белков может быть разделена на группы компонентов. Однако причина такого разделения совершенно иная, поскольку оно определяется отношением молекулярного веса к коэффициенту трения. Комбинация обоих методов привела к установлению наличия в человеческой сыворотке по крайней мере двенадцати различных белков . [c.489]

Все белки денатурируются под действием кислот или при нагревании, что проявляется в коагуляции и уменьЩенин растворимости, а также в потере специфических биологических свойств. Определение молекулярного веса белков является трудной задачей. Исходя из содержания железа в гемоглобине крупного рогатого скота, было найдено, что молекулярный вес этого белка лежит в пределах 16 000— 17 000. Молекулярный вес казеина, определенный по содержанию легко отщепляющейся серы, равен 16 000 и т. д. Подобные выводы, однако, справедливы лншь прн том условии, что данный белок однороден и содержит в своей молекуле только один атом того элемента, который используется для расчета молекулярного веса. Криоскопическое определение молекулярного веса затрудняется тем, что даже растворимые белки образуют коллоидные растворы наблюдаемое малое понижение точки плавления соответствует большому весу мицеллы. Более подходящими являются методы, основанные на определении скорости диффузии и вязкости. Помимо них практическое значение приобрел предложенный Сведбергом способ определения велич1п-1ы частиц по скорости седиментации в ультрацентрифуге. [c.396]

Растворы белков обладают многими свойствами, которые характерны для лиофильных коллоидных растворов. Молекулы белков не проходят через полупроницаемые мембраны, и это используется для их очистки от низкомолекулярных примесей при помощи диализа. Представляет большой интерес определение размеров, формы белковых молекул и молекулярных весов белков. Для этой цели используется целый ряд физико-химических методов. Так, белки в растворах седиментируют в ультрацентрифугах при ускорениях до 200 ООО g , величины констант седиментации колеблются от 1 Ю до 90—100 сек. Коэффициенты диффузии — в пределах от 0,1 10 до 10- 10 средний удельный объем — около 0,75 см г. Размеры и форму (асимметрию) частиц белка определяют, кроме того, методами светорассеяния, двойного лучепреломления в потоке, измерениями вязкости, коэффициента вращательной диффузии, но, по-видимому, наиболее точно — прямым наблюдением в электронном микроскопе в тех случаях, когда молекулы белка достаточно велики и когда удается преодолеть технические затруднения. Молекулярные веса, кроме названных выше способов, определяют методами осмометрии, гель-фильтрации, исследованием монослоев белков на поверхности жидкой фазы, светорассеяния и др. [c.30]

До недавнего времени наиболее надежным средством разделения белков с разными молекулярными весами являлось скоростное центрифугирование в ультрацентрифугах, применявшееся как для определения констант седиментации (осаждения) белка в аналитических исследованиях, так и для препаративного получения некоторых белков. [c.55]

В ультрацентрифуге оседают не только мельчайшие частицы гидрофобных коллоидов, но и молекулы белков и высокомолекулярных веществ. Скорость седиментации V сферических частиц в ультрацентрифуге определяется также уравнением (И. 13), в котором g заменяется где ш — угловая скорость вращения ротора ид — расстояние от частицы до оси вращения. [c.39]

Ультрацентрифуга сама но себе дает не молекулярный вес, а константу седиментации белка 8. По определению, это скорость движения макромолек л в поле с ускорением, равным единице [c.112]

Каждый биохимик, получив исследуемый фермент в кристаллическом виде, испытывает большое и вполне законное удовлетворение. Однако не следует забывать, что одна только кристаллизация фермента не может служить полной гарантией его чистоты. Так, Джекоби, в лаборатории которого за три года было выделено в кристаллическом виде 50 белков [7], сообщил о кристаллизации препаратов всего лишь 30%-ной чистоты. Он еще раз подчеркнул необходимость применения иных критериев гомогенности, таких, например, как ультрацентрифугирование и электрофорез. Однако следует иметь в виду, что при некритичном отношении к постановке эксперимента и на ультрацентрифуге можно получить один пик для гетерогенной смеси. На скорость седиментации частиц в центробежном поле и характер получающихся на седиментационных диаграммах пиков влияет ряд факторов, которые рассматриваются в настоящей книге и которыми некоторые исследователи часто на собственный риск пренебрегают. Именно по этой причине, несмотря на большие возможности применения этого метода в упомянутых выше областях, во многих лабораториях к работе на ультрацентрифуге допускается лишь ограниченный круг лиц, умеющих правильно использовать приборы и интерпретировать получаемые данные. Люди, владеющие этими знаниями, охотно принимаются в исследовательские коллективы, и можно надеяться, что предлагаемая книга послужит увеличению числа таких специалистов. Материал, изложенный в данной книге, рассмотрен достаточно глубоко, но вместе с тем не слишком сложно, что является результатом многолетнего опыта замечательного лектора, читающего курс физико-химических концепций студен-там-биохимикам. [c.10]

Для определения чистоты (или гомогенности) ферментных препаратов в настоящее время наиболее широко используются ультрацентрифугирование и диск-электрофорез. В основе первого из них лежит различная скорость седиментации в ультрацентрифуге белков с различной молекулярной массой (и различной формой молекул). Одним из ограничений данного метода является то, что разные белки могут иметь одну и ту же величину седиментации и не разделяться при ультрацентрифугировании. С другой стороны, белок в растворе может находиться в виде нескольких форм, различающихся по степени агрегации, а следовательно, и по молекулярной массе. Если эти формы не превращаются одна в другую или превращения осуществляются достаточно медленно, на седиментограмме обнаружится несколько пиков, что, однако, не будет свидетельствовать о наличии примесных белков в исследуемом препарате фермента. Недостатком метода является также его невысокая чувствительность, что не позволяет обнаруживать малые количества примесных белков. [c.205]

В эти годы созданы новые физ.-хим. методы аиализа. Были заложены основы хроматографич. методов (М. С. Цвет, 1906). В 20-х гг. Т. Сведберг предложил использовать для седиментации белков ультрацентрифугу, вскоре этим методом был выделен ряд вирусов. В 30-х гг. А. Тизе-лиусом заложены основы электрофореза, в 1944 А. Мартином и др. создана распределит, хроматография, для определения структуры прир. соед. впервые стал использоваться рентгеноструктурный анализ (Д. Кроуфут-Ходжкин, 40-е гг.). Благодаря использованию физ.-хим. методов в 50-х гг. достигнуты крупные успехи в изучении двух важнейших классов биополимеров-белков и нуклеиновых к-т Э. Чар-гафф провел детальный хим. анализ нуклеиновых к-т, открыта двойная спираль ДНК (Дж. Уотсон и Ф. Крик, 1953), определена структура инсулина (Ф. Сенгер, 1953), одновременно осуществлен синтез пептидных гормонов -окситоцина и вазопрессина (Дю Виньо, 1953), открыт один из элементов пространственной структуры белков- спираль (Л. Полинг, 1951). В эти годы Р. Замечником открыты рибосомы, что послужило стимулом для изучения механизма синтеза белка. [c.292]

Пря улыпрацентрифугировании для разделения используется седиментация, зависящая от размера, плотности и формы молекулы белка. Центрифугирование в градиенте плотности (зональное центрифугирование) часто применяется для разделения белков, а также для разделения органелл и вирусов. Одной из характеристик белка служат данные седиментационного анализа в ультрацентрифуге (разд. 3.5.4). Положение возникающих белковых зон можно наблюдать с помощью оптических методов. [c.349]

На ультрацентрифуге, измеряется коэффициент седиментации, определяющий скорость перемещения седиментационной границы. На рис. 3.15 показана седиментационная диаграмма для белка р-лактоглобулина. В ультрафиолетовом свете сфотографированы последовательные во времени положения седименти-рующей границы. Измерив 5, коэффициент диффузии О, а также рм и ро, можно определить М. Величина 5 зависит от концентрации раствора вследствие гидродинамического взаимодействия макромолекул. Значение 5, экстраполированное к нулевой концентрации, [c.151]

В последние годы в связи с развитием новейших методов фракционирования белков (хроматография на ионитах, препаративный электрофорез и т. п.) получены еще более активные препараты холинэстеразы сыворотки крови [83, 84]. Наибольшей активностью характеризуются препараты, полученные Янцем и Коэном [83] (уд. активность 10 /жг). По обычно принимаемым для белков критериям (кривые седиментации в ультрацентрифуге, электрофорез) эти препараты представляют собой индивидуальные белки с коэффициентом седиментации S o 9,9. [c.164]

Молекулярный вес, определяемый по формуле (Х.6), не всегда равен средневесовому молекулярному весу. Это отчасти связано с тем, что при его вычислении используется отношение з к О. Дело в том, что в случае полидисперсных систем с более или менее непрерывным распределением молекулярных весов метод скорости седиментации неприменим, и вместо него нужно пользоваться каким-либо из методов, описанных ниже. В случае гомогенных или гетеродисперсных систем, состоящих из дискретного набора компонентов, измерения скорости седиментации, дополненные измерениями диффузии, позволяют правильно определять молекулярные веса. Разделение компонентов гетеродисперсных белковых смесей с помощью ультрацентрифуги сыграло большую роль в развитии науки, поскольку таким путем было установлено, что белки — это индивидуальные вещества, а не беспорядочные конгломераты молекул меньших размеров. [c.190]

При седиментации рибосом в ультрацентрифуге наблюдаются резкие границы. Коэффициенты седиментации зависят от концентрации двухвалентных катионов магния. Рибосомы из Е. oli, имеющие коэффициент седиментации 70 S и молекулярный вес 3 10 , диссоциируют при концентрации Mg++ 10 М на 30 S- и 50 S-частицы, вес которых равен соответственно 1-10 и 1,8 10 . Первые содержат 16S-PHK (молекулярный вес 0,55 10 ), а вторые — 23 S-PHK (молекулярный вес 1,1-10 ). По аминокислотному составу эти частицы не различаются. При концентрации Mg++, равной примерно 10" М, 70 S-частицы ди-меризуются. При этом образуется 100 S-частицы с молекулярным весом 5,9 10 . Электронные микрофотографии подтверждают выводы, сделанные на основании данных о седиментации и диффузии. Синтез белка идет, по-видимому, в агрегатах рибосом (такие агрегаты называют полисомами). [c.369]

Высокомолекулярная фракция была сконцентрирована в нативном состоянии с помощью сефадекса приблизительно в 30 раз, и при исследовании ее в ультрацентрифуге ФИВЕ на диаграмме седиментации был обнаружен один пик с константой седиментации ( 20,ж), равной 5,94 5. Таким образом, из секрета печеночных митохондрий выделено два усиливающих фактора, из которых один оказался адениннуклеотидом, а другой — белком. По-видимому, в первую очередь, когда гиалоплазма еще лишена коэнзимов гликолиза, действует аденнннуклеотид. Это действие дает гликолизу первый импульс. Затем, после насыщения ферментов коэнзимами, наступает действие белкового фактора это действие вызывает дальнейший подъем гликолиза. [c.115]

Если ультрацентрифуга вращается достаточно долгое время со скоростью порядка 8000—15000 об1мин, то скорость переноса веществ за счет седиментации будет мала и соизмерима со скоростью переноса за счет диффузии. В результате через определенный промежуток времени достигается равновесное распределение концентраций во всей ячейке. Скорость переноса растворенного белка через поверхность поперечного сечения А за счет центробежной силы равна с-А-йх/сИ. Скорость диффузии через ту же поверхность по закону..Фика составляет — 0-А-(1с1(1х. Как следует из уравнения (35), скорость кх1(И равна центробежной силе, деленной на коэффициент трения (<р//). Отсюда результативная скорость движения белка [c.148]

Простьаш методами измерения молекулярных весов полимеров являются осмометрия и измерение светорассеяния. Оба метода применялись к белкам с успехом. Но, несомненно, л> ший из методов — седиментация в ультрацентрифуге.Достоинство последнего в том, что здесь происходит отделение от примесей в самом процессе измерения и мы контролируем чистоту препарата и видим характер загрязнений одновременно с измерением констант чистого белка. Белки были иервьвш полимерами, которые оказались монодиснерсными, т. е. имеющими строгий математически определенный молекулярный вес. Это открытие было [c.111]

Некоторые результаты. Необходимо знать коэфициент диффузии белка, чтобы из скорости седиментации в ультрацентрифуге вычислить его молекулярный вес. Благодаря этому были измерены коэфициенты диффузии большого числа белков. В табл. 40 приведены коэфициенты диффузии некоторых белков и их объемные приведенные вязкости. В табл. 40 О измеренный коэфициент диффузии в квадратных сантиметрах в секунду, а 1>о — коэфициент диффузии сферической негидра-тирован ной молекулы того же самого молекулярного веса. [c.326]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология