Белки кривые титрования

Рис. 112. Кривые титрования трех модельных щелочных белков (1— и тех же обменников, что на рис. 111

Правда, в белке имеются различные кислые и основные группы, но формула (V. 5) остается приближенно правильной, если отнести значения Ка Кв наиболее сильным группам. Для полного определения молярного содержания различных ионо генных групп в белке и их констант диссоциации измеряют ход поглощения Н+ - и 0Н - ионов в широком интервале pH (примерно, pH 2—12), прибавляя к белковому раствору различные количества кислоты или щелочи и измеряя равновесное pH водородным или стеклянным электродом. При помощи этих кривых титрования белков определяют также максимальную емкость поглощения кислот и оснований, т. е. максимальное число зарядов на белковой молекуле. Например, для сывороточного альбумина человека при pH = 2 эта величина составляет 7]о = 100 элементарных зарядов на молекулу белка. [c.114]

Белки — полимеры аминокислот — являются полиэлектролитами. У макромолекулы белка много диссоциирующих кислотных и основных групп с различными значениями р/(. Так, например у р-лактоглобулина найдено ПО титрующихся групп на моль белка, т. е. приблизительно 7з аминокислотных остатков этого белка имеют ионную форму. В отличие от кривой титрования глицина, на которой имеются два перегиба в области pH = p/(i и рН = рК2, кривые титрования белков должны иметь множество перегибов. Большое количество перегибов на кривой титрования свидетельствует о том, что буферные свойства белков проявляются в широком диапазоне pH. [c.34]

Подобно аминокислотам, белки сочетают в себе как кислотные, так и основные свойства. Являясь амфотерными полиэлектролитами, белки тем не менее существенно отличаются от свободных аминокислот, кислотно-основные свойства которых обусловлены а-амино- и а-карбоксильными группами. В белках основной вклад в формирование кислотно-основных свойств вносят заряженные радикалы аминокислотных остатков, расположенные на поверхности белковой глобулы. Основные свойства белков связаны с такими аминокислотами, как аргинин, лизин или гистидин, а кислые — с аспарагиновой и глутаминовой аминокислотами. Что касается а-аминных и а-кар-боксильных групп аминокислот, то их ионизация не имеет существенного значения, так как подавляющее их число участвует в образовании пептидных связей. Кривые титрования белков достаточно сложны для интерпретации. Это связано, во-первых, с наличием большого числа титруемых групп, а также с тем, что рА для каждой титруемой группы в белке может существенно отличаться от таковой в аминокислоте. Это связано с электростатическими взаимодействиями между ионизированными группами белка, наличием близко расположенных гидрофобных остатков, а также влиянием водородных связей. [c.52]

Рассмотрение кривых титрования щелочных белков (рис. 112) позволяет в результате аналогичных рассуждений прийти к выводу [c.265]

Белки и диффузный двойной слой. Абрамсон указал, что должна существовать связь между электрофоретической подвижностью белка кривой титрования белка он сформулировал следующее правило В растворах с одинаковой ионной крепостью электрическая подвижность данного белка при различной активности водородных ионов должна быть прямо пропорциональна числу связанных белком водородных (гидроксильных) ионов . Он указал, что молекула белка в растворе может рассматриваться как две концентрические сферы, из которых внутренняя сфера представляет поверхность молекулы белка, а внешняя сфера — распределение центров тяжести зарядов в диффузном ионном слое. Для этого случая [c.218]

На интервал перехода окраски индикатора влияют температура, присутствующие в растворе посторонние вещества, например, соли, белки, иеводные растворители. Интервал перехода окраски индикатора должен перекрывать положение точки эквивалентности на кривой титрования. [c.332]

Рис. 111. Кривые титрования трех модельных кислых белков (1—3) и слабых ионообменников DEAE- л СМ-целлюлозы (см. рис. 109)

Построив кривую титрования (см. рис. 24) и определив точку эквивалентности, рассчитывают количество сульфгидрильных групп, соответствующее 200 000 г белка. [c.160]

Тот факт, что белки являются многовалентными кислотами и основаниями, определяет важное свойство их структуры. Значения рК кислотных групп в белках приведены в табл. 20,1. Значение р/С данной группы в белке меняется в широком диапазоне из-за влияния соседних частей белка, а также из-за электростатического действия зарядов на остаток молекулы белка. Если суммарный заряд молекулы белка положителен, как это имеет место в ряде кислотных растворов, то протону легче выйти из кислотной группы, и значения р/С понижаются. Если же суммарный заряд отрицателен, как в случае некоторых щелочных растворов, то протону труднее выйти из кислотной группы, и значения рК повышаются. Вследствие этого кривая титрования белка может быть более крутой, чем кривые титрования аминокислотных цепей. На каждом конце полипептидной цепи будет находиться а-карбоксильная или а-ами-ногруппа. Добавочные электрические заряды — это результат связывания ионов белком. В изоэлектрической точке число положительных зарядов равно числу отрицательных зарядов, так что в приложенном электрическом поле белок не движется. [c.602]

Составьте таблицу значений р/Са для кислых и основных групп, входящих в состав белка. Какие из этих групп больше всего влияют на кривые титрования белков [c.191]

Законы электростатики были с успехом использованы также при интерпретации кривых титрования белков, суммарный отрицательный или положительный заряд поверхности которых непрерывно меняется по мере роста числа присоединившихся протонов при переходе от высоких значений pH к низким [17]. [c.260]

Рис. 123. Заряд яичного альбумина как функция pH, определенный из электрофоретической подвижности при использовании уравнения (24-7). Этот заряд сравнивается с зарядом, обусловленным равновесием кислых и основных групп, определенным из кривой титрования. Расхождение частично можно объяснить тем, что заряды, обусловленные кислыми и основными группами в молекуле, не составляют полный заряд иона белка, но часть расхождения должна быть приписана несовершенству уравнения (24-7). Ионная сила в этих экспериментах составляла 0,10 (рисунок взят из работы ) /—заряд, определенный из кривой титрования

Электрические заряды на коллоидных частицах возникают в результате преимущественной адсорбции одного из ионов электролитов из раствора или диссоциации собственных ионогенных групп. Независимо от механизма возникновения зарядов на коллоидных частицах, при достаточной плотности расположения зарядов, образуется двойной электрический слой, состоящий из зарядов на поверхности и из компенсирующих ионов в растворе при этом, по теории Штерна, компенсирующие ионы частично входят в прилегающий к поверхности адсорбционный слой, а частично — в диффузную часть двойного слоя. Изучение заряда поверхности методом электрокапиллярных кривых (на ртути, V. 4) и кривых титрования (золи AgJ, растворы белков) позволили определить точки нулевого заряда (в белках — изоионную точку, V. 5) и установить их смещение в растворах различных электролитов. [c.132]

На фиг. 18 изображены кривые титрования рибонуклеазы — белка с небольшими, почти сферическими молекулами известного аминокислотного состава. В табл. 14 число групп рибонуклеазы, титруемых в различных [c.71]

Исходя из одних только теоретических соображений, получить уравнение, вполне удовлетворительно описывающее кривую титрования белка, невозможно. Для расчета кривой титрования белка часто пользуются следующим уравнением [c.104]

Уравнение (V. 4) часто используют при построении кривых титрования белков. В водных растворах при 25° х есть функция только ионной силы л(к = 0,33 и приведенное выше выражение для со приобретает вид [c.105]

Даже если бы уравнение (V. 4) строго соответствовало теории, все равно оно не могло бы привести к точному согласованию с экспериментом, поскольку сама теория базируется на некоторых допущениях. Прежде всего, форму молекул большинства белков в растворе лишь приближенно можно считать сферической. Кроме того, сомнительна правомерность допущения о равномерном распределении заряда вблизи поверхности белковой молекулы. От кислотных групп, находящихся внутри белковой глобулы, протон должен отщепляться с большим трудом, чем от таких же групп, находящихся на поверхности. К размазыванию заряда могли бы приводить колебания боковых цепей. Однако существуют заряженные боковые цепи, занимающие фиксированное положение на поверхности глобулы. Кроме того, теория исходит из одинакового значения диэлектрической проницаемости во всем объеме. На самом деле при добавлении любого электролита в водный раствор белка молекулы белка поляризуются и поэтому локальная диэлектрическая проницаемость вблизи каждой белковой молекулы может составлять До или даже менее от объемной диэлектрической проницаемости. К сожалению, методов определения истинного значения локальной диэлектрической проницаемости не существует. Таким образом, эта модель приводит к завышению величины электростатического взаимодействия, допуская существование размазанного заряда, и вместе с тем к занижению той же величины, допуская возможность использования объемного значения е благодаря такому компенсационному эффекту теория дает все же результаты, довольно близкие к опытным данным. Анализ кривых титрования глобулярных белков показывает, что они представляют собой достаточно непроницаемые молекулы, внутрь которых ионы не проникают. Молекулы связанной с белком воды располагаются на поверхности глобулы. [c.106]

Принято считать, что амино-(и имино-)кислоты, освобождаюш,иеся при полном кислотном гидролизе, являются фрагментами, точно соответ-ствуюш ими первоначальной ковалентной структуре белков. Аминокислоты рассматривают как единицы, образующие полипептидные цепи за счет повторяющихся пептидных связей (амидного типа) между их карбоксильными и а-аминогруппами [схема (1)]. Большинство сведений (например, растворимость белков, кривые титрования, образование производных) о доступности или реакционной способности функциональных группировок боковых цепей аминокислот в интактных белках определенно подтверждает, что эта точка зрения на структуру белка в основном правильна. Однако этот вывод не окончательный и необходимо иметь в виду возможные отклонения. [c.130]

Мы описали три возможные причины появления аномальных значений рКа, находимых из кривых титрования. На практике, однако, часто бывает очень трудно разделить эти три эффекта, и приходится прибегать к данным о теплоте реакции, энтропии и изменении свободной энергии. Если экспериментальная кривая титрования отличается от кривой, построенной в соответствии с уравнением (V. 4), в котором учтен заряд молекулы, то это можно объяснить либо влиянием гидрофобного ядра, либо возникновением водородных связей молекулы. Эти два случая особенно трудно различимы, так как они часто дают эффект одного знака. Ионизация кислотной группы, находящейся в гидрофобном ядре молекулы, будет протекать при более высоких значениях pH, чем обычно, как из-за пониженного значения диэлектрической проницаемости, так и вследствие образования водородных связей. Аномальную ионизацию белков чаще всего объясняют образованием водородных связей. В последнее время усиленно подчеркивается влияние неполярного гидрофобного ядра. Аномальные кривые часто наблюдаются при титровании карбоновых групп кислот или фенольной группы тирозина — как раз тех групп, которые, как уже было показано, наиболее чувствительны к понижению диэлектрической проницаемости окружающей среды. Если аномальную ионизацию аммонийных групп не удается объяснить наличием заряда молекулы, то весьма вероятно, что она вызывается образованием водородной связи. [c.109]

Полипептиды. Прежде чем перейти к титрованию отдельных белков, мы рассмотрим, как интерпретируются кривые титрования [c.109]

В разделе 28 было указано, что титрование белков может сопровождаться изменением конформации вследствие увеличения свободной энергии электростатического взаимодействия при возрастании заряда. Во многих случаях кривые титрования говорят о наличии таких изменений в конформации. [c.638]

Кривые титрования белков, являющихся полиамфолитами, имеют плавный характер, часто без заметных перегибов. Это обусловлено различными причинами. Макромолекулы белков содержат обычно несколько типов как основных, так и кислотных групп, каждый из которых имеет свое значение рК и характеризуется своей точкой перегиба на кривой титрования. Но даже одному типу групп соответствует несколько значений р/С в зависимости от окружения этих групп на поверхности или внутри белковой глобулы. Наконец, описанные выще электростатические эффекты, которые приводят к сглаживанию кривых титрования поликислот (или полиоснований), действуют так же и в случае полиамфолитов. [c.127]

Разумеется, исследователь редко располагает кривыми титрования всех белко , входящих в состав смеси, и выбор ойтимального значения pH производится эмпирически (как описано ниже). Но здесь мы хотели проиллюстрировать то обстоятельство, что подбор оптимального для фракционирования белков значения pH буфера элюции является делом не только очень важным, но и весьма тонким. Отклонение на одну единицу pH в безобидной нейтральной области для приведенного выше (вполне реального) примера трех кислых белков могло привести к отсутствию разделения двух пз них. [c.265]

Активность миозина в пробах рассчитывают в микромолях неорганического фосфата за 1 мин на 1 мг белка. Проводят сопоставление кривой титрования сульфгидрильных групп миозина ПХМБ и кривой изменения его активности при разной степени модификации. Отмечают полную потерю активности ферментом при 100%-ном блокировании SH-rpynn, а также 1,5—3-кратную активацию АТФазы при блокировании до 50% SH-rpynn. [c.399]

В частицах лиофобных золей всегда содержится компактное ядро, лишенное электрических зарядов. Напротив, в частицах белков и полиэлектролитов подобное ядро отсутствует, и они по всей своей массе несут способные к диссоциации ионогенные группы. В белках ионогенные группы имеют различную химическую природу — кислые карбоксильные, основные амино-группы и др., вследствие чего белки относятся к классу амфотерных электролитов. При крайних рн резко преобладает диссоциация групп одного знака и, например, при рН-2 белковая молекула несет лишь положительные заряды. Однако тот же заряд при кислых рн можно представить, по Бьерруму и Линдер-штрем-Лангу, обусловленным не диссоциацией солеобразных аминогрупп, а адсорбцией Н+-ионов из раствора и подавлением диссоциации СОО -групп на белковой молекуле. При любом предположении белковая молекула при данном pH несет точно определенное число зарядов, а компенсирующие ионы располагаются в растворе с определенной плотностью распределения, что, соответственно, измеряется при помощи кривых титрования и электрофоретической подвижности (см. ниже). [c.105]

Другими важными методами разделения и очистки белков являются злектрофо-рез и ионообменная хроматография. Оба метода основаны на различных свойствах частиц, несущих неодинаковый заряд. Величина и знак заряда для каждого белка характеризуются числом ионизируемых боковых групп аминокислотных остатков и, как в случае аминокислот (разд. 1.4.2), могут быть установлены из кривой титрования. Выше ИЭТ находится зона pH с отрицательным, а ниже. ИЭТ — зона pH с избыточным положительным зарядом молекулы. [c.350]

В изоэлектрической точке белковая молекула представляет собой цвиттер-иои, т. е. положительные и отрицательные заряды в молекуле взаимно уравновешиваются и суммарный заряд молекулы равен нулю растворимость и гидратация минимальны, отсутствует движение в электрическом поле. Изоэлектрическая точка может быть определена из кривой титрования, отражающей суммарное состояние ионизации молекулы. В случае глобулярных белков ионизируемые группы преимущественно локализова-, ны иа поверхности молекулы. Группы, находящиеся внутри или принимаю- щие участие в образовании водородных связей, могут быть зарегистрированы титрованием после денатурации. Кроме того, изоэлектрическая точка( может быть установлена путем определения минимума растворимости й [c.356]

О возможности миграции ацильной группы в разбавленных водных растворах кислот высказывались различные предположения. Тенфорд [308] изучал кривые титрования нескольких подробно охарактеризованных белков (инсулин, рибонуклеаза, лизоцим, р-лактоглобулин, овальбумин и альбумин сыворотки крови человека). Он установил, что по крайней мере для указанных белков отсутствуют данные, свидетельствующие об увеличении количества аминогрупп при pH 2 — самом низком значении, достигнутом в ходе титрования. Приведенные выше данные показывают, что перегруппировка легче происходит в концентрированных водных растворах кислот. [c.222]

Возможность получения количественных данных по связыванию для взаимодействия белков с иммобилизованным пептидом впервые исследована Гавронским и Уолдом [8]. Определена константа диссоциации, равная (2,5 1,0) 10 моль/л, путем прямого титрования 5-белка рибонуклеазы, связанного с 5-пептидом, иммобилизованным на агарозе. Хорошие кривые титрования получены при концентрации 8-белка 10 —моль/л. Когда концентрация связанного белка равна концентрации белок-пептидного комплекса, взаимодействие может быть описано соотношением [c.58]

Как мы увидим в гл. 6, первым шагом на пути установления структуры данного белка является его гидролитическое расщепление на составляющие аминокислоты. После этого необходимо определить, какое количество аминокислот каждого типа содержится в этом белке. Казалось бы, должно потребоваться много труда и терпения для того, чтобы разделить образовавшуюся после гидролиза смесь аминокислот, идентифицировать их и количественно определить со-держЫие каждой из 20 аминокислот. Однако в настоящее время разработаны очень эффективные и чувствительные методы, позволяющие решать такие задачи достаточно быстро. К подобным методам относятся, в частности, электрофорез и ионообменная хроматография. Оба этих метода основаны на различиях в кислотно-оснбвных свойствах аминокислот, т. е. на различиях в знаке и величине суммарного электрического заряда при данном значении pH, которые можно легко предсказать исходя из величин рК й кривых титрования исследуемьк аминокислот. [c.123]

Интерпретация кривых титрования белков сложна и не всегда однозначна. Эхо обусловлено двумя причинами. Во-первых, в каждой молекуле белка обычно содержится большое число титруемых групп (в среднем на 100 ООО единиц молекулярного веса приходится от 50 до 60 таких групп). Во-вторых, значения рйГц для каждой из титруемых групп в белках могут заметно отличаться от соответствующих значений рй для свободных аминокислот (см. табл. 8). Так, например, в белке, содержащем 10 остатков аспарагиновой кислоты, каждая из р-карбоксильных групп этой аминокислоты характеризуется своим особым значением рЛТ (варьирующим в пределах от 3 до 6). Такие различия в величине рЛГ для одних и тех же групп в белках (или в других заряженных макромолекулах) обусловлены главным образом тремя причинами 1) электростатическими взаимодействиями с другими ионизиро- [c.70]

В области 2<рН<11,5 кривая титрования яичного альбумина обратима. Результаты расчетов, аналогичных тем, которые были приведены выше для р-лактоглобулина (и при тех же ограничениях), согласуются с аналитическими данными в частности, из них следует, что молекула яичного альбумина содержит 14 гуанидиновых групп. Если предположить, что количество связываемых (независимо от значения pH) солей мало, то полную кривую титрования этого белка можно представить себе как результат наложения трех описываемых уравнением (V. 4) кривых— для 51 карбоксильной группы (р/гш1=4,29), 5 амидазоль-ных групп (р 1п1 = 6,75) и 23 групп NHI (р 1п1= 10,07). Для всех трех типов групп характерно одно и то же значение, причем вплоть до ионной силы, равной единице, это значение составляет 80% от значения, вычисляемого из молекулярного веса и парциального удельного объема (в предположении отсутствия гидратации). [c.117]

Подобные данные для белка лизоцима содержатся в работе Бейтчока и Варнера . Здесь наблюдается даже большее расхождение между величинами 2, определенными из электрофореза и из кривой титрования. В этом примере имелись фактические данные по связыванию иона хлора. Однако эксперименты по электрофорезу были проведены в буферных растворах, содержащих ионы Н2РО4, НСОО- или СН3СОО-. [c.487]

Все белки содержат разнообразные кислотные и основные участки. В некоторых белках равновесие этих участков с ионами водорода определяется с большим трудом, так как возрастание заряда при титровании иногда может сопровождаться необратимыми изменениями конфигурации ( денатурацией ). Однако в случае многих белков, макромолекулы которых невелики, такие трудности не возникают вообще или же появляются только в крайних областях кривой титрования. В этих случаях равновесие легко определяется экспериментально и с некоторым приближением подчиняется уравнению (30-1). Если рассматриваемые белки глобулярны, их макромолекулы могут быть компактны и непроницаемы для растворителя в широком интервале pH, и поэтому фактор электростатического взаимодействия ш, входящий в уравнение (30-1), может быть выведен из уравнения (26-30) для и определяется выражением (29-32). Характеристические константы Кхзр. должны соответствовать константам диссоциации малых молекул, содержащих те же самые диссоциирующие группы. [c.626]

По крайней мере некоторые из этих отклонений от приближенной теории могут быть объяснены при использовании более реалистичной схемы расчета кривой титрования. Другие отклонения, видимо, связаны с особенностями конформации. Например, хорошо известно, что фенольные ОН-группы могут создавать довольно прочные водородные связи с атомами, имеющими свободные-пары электронов. Энергия разрыва такой связи равна около 6000 кал1моль. Если бы каждая фенольная группа молекулы белка участвовала в образовании водородной связи, АН1ар. отщепления протона увеличилась бы на 6000 тл, так как отщеплению протона предшествовал бы разрыв водородной связи. Энтропия диссоциации также изменилась бы, так как можно ожидать, что образование водородных связей в белках должно ограничивать свободу вращательного движения боковых групп. (Например,, вращение вокруг ординарной связи между СНа-группой и бензольным кольцом в фенольной СНз—СбН —ОН-группе должно сопровождаться вращением атома водорода гидроксильной группы вокруг оси, параллельной этой связи если атом водорода связан водородной связью, то ясно, что такое вращение невозможно.) Таким образом, энтропия фенольной группы, участвующей в образовании водородной связи, ниже энтропии свободной фенольной группы, и поэтому величина А5 р. для отщепления водородного иона от фенольной группы должна быть соответственно более положительной, чем обычно. Ласковский и Шерага оценили, что изменение величины А5хар. может достигать 20— [c.633]

Наконец, представляет интерес сделать еще одно замечание. По уравнению (30-6) можно определить средний общий заряд 2 первоначально изоионного белкового препарата как указывалось выше, это значение обычно очень мало. С другой стороны, по кривой титрования мы можем найти максимальное число ионов Н , которое может присоединиться к изоионной белковой макромолекуле. Сумма этих двух величин представляет собой наибольший положительный заряд, вызванный наличием ионов Н" , который может приобрести макромолекула белка. Это число равно общему количеству катионных участков (ЫНз и т. д.) в макромолекуле. Поэтому его можно определить по кривой титрования даже несмотря на то, что некоторые из катионных участков (гуанидильные группы) не титруются в экспериментально доступной области pH. Таким путем (по разности) было найдено число гуанидильных групп указанное для рибонуклеазы в табл. 38. [c.637]