Эндонуклеазы АТР-зависимые

Дезоксирибонуклеазы (К-Ф.3.1.4.5) — собирательное название многих с различной степенью специфичности гидролизующих ДНК ферментов. Их можно разделить на две группы эндонуклеазы и экзонуклеазы. Эндонуклеазы весьма условно также делятся на две группы — ДНК-аза I и ДНК-аза П. Действие ферментов первой группы приводит к образованию из ДНК дезоксинуклеозид-5 -фосфатов. Действие второй группы заканчивается образованием дезоксинуклеозид-З -фосфатов. Со временем все очевиднее становится условность такого разделения, поскольку между этими двумя крайними случаями обнаруживается большая часть других ферментов этого класса. В настоящее время описано много ДНК-специфических эндонуклеаз различного биологического происхождения. Большой теоретический и практический интерес среди них представляют так называемые рестриктазы — эндонуклеазы, которые весьма специфически, в зависимости от нуклеотидной последовательности расщепляют ДНК- Такими являются, например, бактериальные эндонуклеазы, способные расщеплять вирусную ДНК, отличающуюся от ДНК хозяина характером структурной модификации. [c.48]

Ультрафиолет в зависимости от длины волны и дозы может вызывать как летальный, так и мутагенный эффект. При этом наблюдается повреждение прежде всего молекул ДНК (особенно при X = 260 нм). В молекуле возникают тиминовые димеры, ингибирующие репликацию. Эти повреждения могут быть устранены двумя путями фотореактивацией и темновой репарацией. В первом случае на поврежденное место садится фермент, активируемый синим (видимым) светом, и исправляет структуру ДНК, устраняя связи между тиминовыми основаниями в димерах. Во втором случае свет не нужен, работают ферменты эндонуклеаза (вырезает поврежденный участок), полимераза (синтезирует правильную структуру по комплементарной цепи) и лигаза (сшивает синтезированные последовательности). [c.100]

Вышеуказанными недостатками не обладают рестриктазы II типа. Нуклеотидные последовательности, узнаваемые этими ферментами, состоят из 4—8 нуклеотидных пар и отличаются вращательной симметрией второго порядка. Эти ферменты расщепляют ДНК полностью по всем узнаваемым участкам. Некоторые специфические эндонуклеазы способны узнавать ассиметричную последовательность нуклеотидов и расщеплять ДНК на расстоянии 5—13 пар оснований в сторону от узнаваемого участка. В других случаях узнаваемая последовательность нуклеотидов является прерванной — симметричные участки разделены любыми нуклеотидными парами. Однако, во всех случаях, вне зависимости от структурных особенностей узнаваемого участка, наблюдается исчерпывающий гидролиз ДНК. Способность рестриктаз II типа высокоспецифично к исчерпывающе расщеплять ДНК на фрагменты, соответствующие по длине расстояниям между узнаваемыми участками, предопределило широкое использование этих ферментов в качестве аналитических реагентов в исследованиях, в той или иной мере связанных с изучением и характеристикой структуры ДНК и в опытах по генетической инженерии. Именно рас смотрению этих ферментов посвящен настоящий обзор. [c.12]

Эти ферменты являются компонентами системы рестрикции — модификации прокариотических клеток, которая предназначена для их защиты от чужеродных ДНК. К рестрикционным эндонуклеазам относятся также и все другие ферменты, специфически расщепляющие ДНК по определенной последовательности, хотя часто их роль в процессах рестрикции — модификации не доказана. В зависимости от характера узнаваемой нуклеотидной последовательности ( сайта ), мест расщепления и условий реакции ре-стриктазы делятся на три класса. [c.309]

Г0 порядка. В зависимости от типа рестриктирующей эндонуклеазы в месте расщепления двухцепочечной ДНК образуются либо тупые , т.е. заполненные концы (как в случае описанной выше Hind II), либо выступающие концы (примером может служить эндонуклеаза Есо RI из Е. соН). В последнем случае два перекрывающихся конца называют липкими, поскольку они способны образовать друг с другом комплементарные пары оснований. [c.881]

АТФ-зависимые эндонуклеазы — ДНК-специфичные эндонуклеазы, активность которых зависит от присутствия АТФ. Один из этих ферментов получен из т. Шещ действует преимущественно на нативную двухцепочечную ДНК. В продуктах егой еак-ции образуются фрагменты с 5 -монофосфатами на конце. Другой подобный фермент получен из Е. oli. Его особенность в том, что он гидролизует одноцепочечную кольцевую ДНК фага fd. Очищенные препараты этого фермента обладают также экзонук-леазной активностью по отношению к нативной ДНК, причем и для этой активности требуется АТФ. Обе активности связывают с процессами рекомбинации. [c.39]

Рестриктазы — специфические бактериальные эндонуклеазы, которые в зависимости от последовательности нуклеотидов расщепляют чужеродную ДНК, омичаю-щуюся по характеру строения от ДНК хозяина. Для появления-вктивности очищенного препарата рестриктазы из Кишечной палочки (ее" раньше называли экзонуклеазой П1) необходимо наличие ионов АТФ и 5-аденозилметионина. Этот фермент, [c.74]

ДНК (гл. 2 и 32). Механизм ее действия в отношении неправильного основания схематически изображен на рис. 34.8. Из фосфодиэфирного остова основание удаляется, в результате чего образуется апуриновый сайт. Этот сайт специфически узнается АР-эндонуклеазой (АР символизирует отсутствие пурина или пиримидина в зависимости от конкретного фермента), которая вносит разрыв на 5 -стороне сайта. Затем могут следовать этапы эксцизионной репарации. [c.438]

Неизвестно, насколько универсален описанный механизм инициации репликации, основанный на действии ori-специфичной эндонуклеазы. Участие в инициации репликации хромосомы Е. соИ топоизомеразы II (ДНК-гиразы) позволяет предположить возможность существования альтернативного механизма инициации, не связанного с участием особой эндонуклеазы. ДНК-гираза направляет АТР-зависимый процесс расплетания двойной спирали, вводя отрицательные супервитки. Это может приводить к необходимому экспонированию матричных нитей без внесения одноцепочечного разрыва в точке начала репликации. [c.120]

II и III. Все рестриктазы узнают на дв)спиральной ДНК строго определенные нуклеотидные последовательности. Однако рестриктазы класса I осуществляют разрывы в произвольных точках молекулы ДНК, а рестриктазы классов II и III узнают и расщепляют ДНК в строго определенных точках внутри сайтов узнава-нмя или на фиксированном от них расстоянии. Ферменты типов 1 и III имеют сложную субъединичную структуру и обладают двумя типами активностей — модифицирующей (метилирующей) и АТФ-зависимой эндонуклеазной. Ферменты И-го класса состоят из двух отдельных белков рестрицирующей эндонуклеазы и модифицирующей метилазы. В силу указанных причин в генной инженерии используют исключительно рестриктазы класса II. [c.139]

При первых делениях аскоспоры тип спаривания переключается на противоположный пцд контролем гена НО (от англ. homo-thallism). Ген НО кодирует эндонуклеазу, которая производит двунитевой сайт-специфический разрез ДНК в локусе МАТ или МАТа в зависимости от того, какая аллель присутствует в этом локусе. Двунитевой разрез инициирует направленную конверсию, при которой генетическая информация кассеты HML i замещает информацию, содержащуюся в локусе МАТ (или HMR замещает информацию МАТа). При этом кассеты сохраняют содержащийся в них генетический материал, а генетический материал, находившийся в локусе МАТ, теряется. Такое переключение происходит только в двух клетках на стадии микроколонии, состоящей из четырех клеток. После этого клетки типа спаривания а копулируют с клетками типа спаривания а. Образуются диплоидные клетки, гетерозиготные по МАТ /МАТц, и ген НО выключается. Далее гетерозиготный диплоид стабильно размножается до нового мейоза и споруляции, после чего при изоляции аскоспор весь процесс в ходе их прорастания повторяется. [c.431]

Как уже упоминалось, одним из простых и эффективных методов обнаружения метилированных остатков С и А в ДНК является использование эндонуклеаз рестрикции, чувствительных к метилированию (ЭРЧМ) (см. раздел 2.2) (рис. 21, а). В этом случае инкубация изучаемой ДНК с ЭРЧМ в зависимости от статуса метилирования исследуемого участка может приводить или не приводить к разрушению ампликона и подавлению его амплификации в ПЦР. Однако, поскольку не всегда в нужных местах генома присутствуют соответствующие сайты рестрикции, применение таких ферментов имеет ограничения. При другом распространенном подходе, лишенном этого недостатка, используют способность бисульфита (HSO3) превращать в оц ДНК остатки С [c.220]

Фрагменты ДНК, предназначенные для клонирования, получают химическим и ферментативным синтезом, гидролизом клонируемой ДНК рестриктазами и другими эндонуклеазами, дроблением ее гидродинамическим способом или ул1тразвуком Подбором условий в определенных пределах можно задавать их длину, но в ряде случаев в зависимости от емкости векторов и необходимости их эффективного использования фрагменты ДНК перед клонированием фракционируют по размеру. Образующиеся двунитевые фрагменты ДНК обладают разными концами, что определяет выбор метода их присоединения к векторнь 4 молекулам. Если фрагменты синтезированы или получены воздействием рестриктаз, концы их могут быть ровными (тупыми) или липкими, фрагменты, полученные в результате неспецифического дробле ния ДНК, имеют на концах случайные однонитевые участки. При этом разрывы распределяются по молекулам случайно, так что среди образовавщихся фрагментов ДНК всегда содержится любой из генов в неповрежденном виде. Это особенно важно при создании банка генов. Расщепление ДНК рестриктазами, естественно, носит неслучайный характер. Если в клонируемом гене имеется сайт узнавания используемой рестриктазы, то ведут ограниченный гидролиз ДНК, чтобы не разрушить этот ген. [c.241]

Экстракты цитозоля клеток, выращенных при дефиците железа, содержат белок, специфически связывающийся с IRE (IRE-BP). При избытке железа содержание функционально активного IRE-BP уменьщается. Согласно одной из гипотетических моделей регуляции IRE-зависимой деградации TfR-мРНК под действием железа, связывание IRE-BP (или его комплекса с другими белками) с кластером щпилек защищает IRE или примыкающие к нему участки от действия эндонуклеазы (рис. 8.119). Полагают, что первоначальное эндонуклеазное расщепление приводит к быстрому экзонуклеазному расщеплению остальной части мо- [c.151]

Детальное изучение [34] влияния температуры на гидролиз ДНК olE I рестрикционной эндонуклеазой E oR I выявило довольно сложную зависимость механизма реакции от температуры. Так, в области температур О—10° С, наблюдается накопление в растворе формы ДНК, содержащей однонитевый разрыв, что подтверждает данные работы [266]. В области температур 25—37° С накопление кольцевой формы ДНК в растворе не наблюдается, так как расщепление обеих цепей ДНК происходит, по-видимому, в составе одного из того же фермент-суб-стратного комплекса, с образованием линейной формы ДНК. Однако, в области температур 40—55° С, наряду с образованием линейной формы ДНК, наблюдается накопление кольцевой формы ДНК [c.72]

Метод трансфекции, зависимой от катионов кальция, имеет несколько меньшую эффективность (до 10 БОЕ на молекулу ДНК фага А), чем метод с использованием сферопластов, однако он гораздо проще и дает хорошо воспроизводимые реззшьтаты. Необходимо отметить, НТО СаСЬ-зависимая трансфекция успешно осуществляется лишь на ограниченном числе изученных штаммов Е. соН, а на ее эффективность существенно влияет генотип клетки. Например, у Е. соН К12 делеция галактозного оперона приводит к удалению галактозы из липополисахаридной оболочки и значительно усиливает способность штаммов к трансфекции ДНК фага А мутация endA вызыкасг исчезновение пери-плазматической эндонуклеазы I, что сущест- [c.83]

Эндонуклеазы типов I и II. Ферменты, относящиеся к фуппе эндонуклеаз типов I и II,— это сложные белки, обладающие активностями рестриктирующей эндонуклеазы и метилазы. Эти интересные ферменты не используются, однако, при конструировании рекомбинантных молекул ДНК. Ферменты типа I связываются с ДНК в специфических участках и затем производят двух цеп очечные разрезы на разном расстоянии от сайтов узнавания, варьирующем от 400 п.н. до 7 т.п.н. Для осуществления ферментативного гидролиза ДНК необходимы АТР и 8-аденозилметионин. Последний активирует фермент. Разрезание сопровождается гидролизом АТР, при этом фермент утрачивает эндонуклеолитическую активность, но сохраняет АТРаз-ную. Таким образом, эндонуклеазы типа I являются ДНК-зависимыми АТРазами. Кроме того, они [c.214]

Липкие KOHupi. Эндонуклеаза Есо RI производит ступенчатые двухцепочечные разрезы, при этом у образующихся фрагментов ДНК на концах образуются короткие комплементарные одно цеп очечные хвосты из четырех оснований-5 -ААТТ-3 (рис. 4.5). В зависимости от ионной силы раствора и температуры эти комплементарные хвосты либо остаются спаренными, либо денатурируют, и тогда образуются отдельные фрагменты с короткими одноцепочечными выступами на 5 -концах. При соответствующих условиях комплементарные хвосты воссоединяются (рис. 4.5). Одноцепочечные концы, образующиеся при расщеплении ДНК эндонуклеазой Есо RI, получили название липеих, поскольку они способны спариваться (как бы слипаться) друг с другом. Важным следствием образования ступенчатых разрывов является то, что фрагменты, получающиеся в результате обработки эндонуклеазой Есо RI двух разных ДНК (например, ДНК Е. oli и дрожжей), могут соединяться с помощью липких концов. При этом различия, затрагивающие двухцепочечные спиральные сегменты указанных ДНК, на процесс соединения не влияют. [c.215]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология