Эндонуклеаза специфичная

В клетке межнуклеотидные связи в ДНК и РНК расщепляются нуклеазами — обширным классом ферментов, представители которого различаются по механизму действия и специфичности (табл. 1), Среди нуклеаз, приведенных в таблице, нужно особо выделить эндонуклеазы рестрикции (рестриктазы). ферменты (их функции рассмотрены в гл. VI) узнают в молекулах ДНК не отдельные нуклеотидные остатки, а нуклеотидные последовательности из четырех, пяти или шести остатков и поэтому расщепляют любую ДНК на сравнительно небольшое число строго определенных фрагментов. [c.13]

Бактерии часто переваривают и разрушают ДНК вторгшихся в них вирусов или ДНК, попавшую в клетку при спаривании с бактерией несовместимого штамма. В результате исследований этого интересного явления, получившего название рестрикция, было обнаружено, что ДНК вирусов, способных к репликации лишь в определенных клетках-хозяевах, в специфических местах каким-то образом маркирована. Причем во многих случаях метками являются метильные группы. Оказалось, что соответствующим образом метилированная ДНК не расщепляется бактерией, тогда как неметилированная ДНК расщепляется высокоспецифичной эндонуклеазой именно в тех местах, в которых обычно происходит метилирование. У каждого вида бактерий (а часто даже и у отдельных штаммов в пределах данного вида) имеются свои собственные рестриктирующие ферменты. Рестриктирующие ферменты обладают очень высокой степенью специфичности и часто разрезают ДНК всего лишь в нескольких точках (или рядом с ними), для которых характерна уникальная последовательность оснований. В настоящее время удалось выделить около 45 таких ферментов с разной специфичностью. [c.279]

Нуклеаза стафилококков является примером фосфодиэстеразы с малой субстратной специфичностью, поскольку она расщепляет ДНК, РНК и олигонуклеотиды до З -мононуклеотидов [31]. Нуклеаза стафилококков получена в кристаллическом виде определены ее аминокислотная последовательность и трехмерная структура. Необычность фермента заключается в том, что для проявления активности он нуждается в ионах кальция. Ион металла присоединяется к нуклеазе только в присутствии субстрата или ингибитора, например тимидин-3, 5 -дифосфата. Нуклеаза стафилококков действует как эндонуклеаза, но после того, как осуществлены разрывы цепи, она может действовать как экзонуклеаза. [c.145]

В дальнейшем выяснилось, что один и тот же штамм может осуществлять несколько типов рестрикции и модификации. Из клеток, способных к рестрикции, были выделены эндонуклеазы, специфичные к определенным нуклеотидным последовательностям неадекватно модифицированной ДНК. Эти ферменты широко применяются в работах по генной инженерии (см. гл. 11). [c.222]

Помимо рассмотренных выше эндонуклеаз известен целый ряд ферментов, отличающихся меньшей специфичностью. Свойства ряда эндонуклеаз, которые могут быть применены для структурного анализа, приведены в табл. 1.3. [c.71]

Дезоксирибонуклеазы (К-Ф.3.1.4.5) — собирательное название многих с различной степенью специфичности гидролизующих ДНК ферментов. Их можно разделить на две группы эндонуклеазы и экзонуклеазы. Эндонуклеазы весьма условно также делятся на две группы — ДНК-аза I и ДНК-аза П. Действие ферментов первой группы приводит к образованию из ДНК дезоксинуклеозид-5 -фосфатов. Действие второй группы заканчивается образованием дезоксинуклеозид-З -фосфатов. Со временем все очевиднее становится условность такого разделения, поскольку между этими двумя крайними случаями обнаруживается большая часть других ферментов этого класса. В настоящее время описано много ДНК-специфических эндонуклеаз различного биологического происхождения. Большой теоретический и практический интерес среди них представляют так называемые рестриктазы — эндонуклеазы, которые весьма специфически, в зависимости от нуклеотидной последовательности расщепляют ДНК- Такими являются, например, бактериальные эндонуклеазы, способные расщеплять вирусную ДНК, отличающуюся от ДНК хозяина характером структурной модификации. [c.48]

Таким образом, разработанный подход позволяет достаточно легко переносить гибридные плазмиды из Е. oli в разные грамположительные бактерии, которые не обладают физиологической компетентностью. Более того, в процессе конъюгационной передачи в клетку-реципиент переносится одна цепь донорной плазмиды, на которой синтезируется затем комплементарная цепь ДНК. Это приводит к тому, что конъюгационно передаваемая плазмида не подвергается атаке рестриктаз — эндонуклеаз, специфично воздействующих на немодифициро-ванные двухцепочечные молекулы ДНК. [c.239]

Некоторые реакции, катализируемые эндонуклеазами, специфичными в отношении одноцепочечных участков. А. Отшепление одноцепочечных хвостов у дуплексной ДНК. Б. Разрезание дуплексной ДНК с локальзно расплетенным участком на два фрагмента. В. Разрезание дуплексной ДНК со шпильзкой на конце с образованием одного двухцепочечного дуплекса. Г. Разрезание дуплекса с пробелом с образованием двухцепочечных спиральных сегментов. Д. Разрезание дуплексной ДНК с одноцепочечной петлей в середине на двухцепочечные фрагменты. [c.213]

Псевдомонада Alteromonas espejiana сегрегирует единственную дезоксирибонуклеазу, получившую название й/31. В отношении одноцепочечной ДНК, в том числе одноцепочечных участков двухцепочечной ДНК, Balil ведет себя как эндонуклеаза, действуя аналогично другим эндонуклеазам, специфичным к одноцепочечным ДНК. Однако в отношении интактной двухцепочечной ДНК этот фермент проявляет экзонуклеазную активность, по-ви- [c.213]

Механизмы С. у разл. классов РНК различаются между собой. Для всех них характерна точность удаления интронов и соединения экзонов. Специфичность удаления единств, интрона, если он имеется в пре-тРНК, обеспечивается ее трехмерной структурой. Эндонуклеаза, ассоциированная с ядерной мембраной, с участием др. ферментов расщепляет предшественник на участках (сайтах) по краям интрона с образованием на концах экзонов 2 , 3 -циклофосфатного и 5 -гидроксильного концов (рис. 1). Соединение этих кон- [c.409]

Экзонуклеазы отщепляют нуклеотиды с концов полинуклеотидных цепочек, в то время как эндонуклеазы делают разрывы внутри цепи. Одни из них гидролизуют лишь одноцепочечные молекулы, другие— двухцепочечные. Некоторые нуклеазы разрывают обе цепи ДНК, тогда как другие надрезают молекулу, внося разрыв лишь в одну из цепей. Специфичность ряда нуклеаз отражена в табл. 2-11. Частичный ферментативный гидролиз РНК дает расщепление молекулы на короткие нуклеотидные последовательности, позволяющие далее определить полную последовательность РНК. (Первой РНК, для которой установлена последовательность, была аланиновая тРНК. Расщепление проводили с помощью панкреатической рибонуклеазы и рибонуклеазы Т1 [133]. Очень полезным методом получения нуклеотидных карт оказался двумерный электрофорез в полиакриламидном геле [134]. [c.168]

Существует три вида ферментов, разрушающих (деполимери-зующих) нуклеиновые кислоты (а) фосфотрансферазы — эти эндонуклеазы разрушают РНК с соучастием 2 -гидроксильной группы рибозы, которая атакует атом фосфора на стадии расщепления цепи, перенося таким образом фосфатную группу с 5 -гидрок-сильной группы соседнего нуклеотида на 2 -группу (б) фосфодиэстеразы— существует большое количество этих ферментов (которые могут быть эидо- или экзонуклеазами), различающихся по своей специфичности к основаниям и углеводным остаткам (в) фосфорилазы — ферменты этого класса расщепляют поли-нуклеотидную цепь по ортофосфату так, что обычно процесс развивается с одного конца цепи. [c.142]

Относительная легкость очистки образцов тРНК и мРНК, наряду с доступностью эндонуклеаз для РНК, обладающих различной специфичностью к основаниям, позволили впервые определить последовательности оснований в таких молекулах в 1965 г. Ранние методы Холли [28] и Захау [29] были вскоре вытеснены методами, разработанными Сенджером для определения последовательности 55 РНК. [c.193]

Частоту появления рекомбинантных бакуловирусов удалось повысить с менее чем 1% до 99%. Для этого ДНК A MNPV обрабатывали эндонуклеазой рестрикции, которая расщепляла ДНК в двух специфичных сайтах с высвобождением фрагмента, несущего часть гена, необходимого для осуществления литического цикла. Клетки насекомого трансфицировали этим фрагментом, а затем — транспортным вектором. В результате двойного кроссинговера в некоторых клетках восстанавливался кольцевой геном A MNPV, который содержал клонированный ген и функциональный ген, необходимый для осуществления литического цикла. В результате почти все вирулентные бакуловирусы оказывались рекомбинантными. [c.155]

Изменение специфичности фермента Олигонуклеотид-направленный мутагенез используют в основном для улучшения уже суше-ствуюших свойств ферментов, но, вероятно, с его помошью можно изменять ферменты таким образом, чтобы они преобретали другую специфичность. Например, таким способом на основе относительно неспецифичной эндонуклеазы Еок были получены новые сайтспецифичные эндонуклеазы. [c.173]

Сайт-специфичные дезоксирибонуклеазы Эндонуклеолитическое расщепление (эндонуклеазы рестрикции) ДНК с образованием специфичных [c.458]

Провести в жизнь эту программу удалось пока только в случае сравнительно коротких цепей (ок. 400 звеньев). Для тРНК известно уже ок. 30 структурных формул. Для успеха решающее значение имело нахождение ферментов, т. н. эндонуклеаз (они выделяются из микроорганизмов), специфично расщепляющих внутренние эфирные связи цепи РНК. Примером удачного фермента служит гуанил-РНК аза, способная расщеплять РНК только по остаткам гуаниловой кислоты. При относительно низких темп-рах и за короткое время подобные эндонуклеазы позволяют осуществить разбиение цепи рибонуклеиновой кислоты на большие и притом воспроизводимые блоки. [c.196]

Межнуклеотидные связи в ДНК и РНК можно химически расщепить с помощью гидролиза. Их можно гидролизовать и ферментами, которые называются ну-клеазами. Некоторые нуклеазы способны расщеплять связи между двумя соседними нуклеотидами, расположенными внутри цепи ДНК или РНК такие нуклеазы называют эндонуклеазами. Нуклеазы другого класса могут катализировать гидролиз только связи концевого нуклеотида-или у 5 - или у 3 -конца молекулы эти ферменты относятся к экзонуклеазам. Дезоксирибонуклеазы, специфически расщепляющие определенные межнуклеотидные связи в ДНК, и рибонуклеазы ферменты, специфичные к РНК, найдены во всех живых клетках. Они секретируются, в частности, поджелудочной железой в кишечный тракт, где принимают участие в гидролизе нуклеиновых кислот в процессе пищеварения. Ниже мь1 увидим, что различные типы эндонуклеаз представляют собой важный биохимический инструмент для контролируемого расщепления ДНК и РНК на меньшие фрагменты при определении их нуклеотидной последовательности. [c.857]

ДНК бактерий данного вида защищена двумя близкими по своей специфичности ферментами 1) модифицирующей метилазой и 2) рестриктирующей эндонуклеазой. Модифицирующая метилаза отвечает за образование специфической для данного вида картины метилирования в определенньЕя коротких последова- [c.880]

Фермент рибонуклеаза из поджелудочной н<елезы быка — хорошо охарактеризованный белок, полная структура которого теперь уже известна (см. стр. 94)— расщепляет нолинуклеотидную цепь аналогичным способом. Этот фермент представляет собой эндонуклеазу, т. е. он атакует внутри-нуклеотидные связи. При этом для действия его необходимо, чтобы фосфатная группа, участвующая в образовании чувствительной к расщеплению Р — 0-связи, была присоединена в положении 3 пиримидинового нуклеозида. Первая стадия расщепления, т. е. образование циклических фосфатов из полинуклеотидов, по-видимому, обратима. Того же типа расщепление (по положению Ь) вызывают фосфодиэстеразы, выделенные из различных источников растительного происхождения (например, из растений гороха, табака или райграса). Все эти фосфодиэстеразы относительно неспецифичны в том смысле, что для их действия безразлична природа оснований, входящих в состав чувствительных нуклеотидов. Известен, однако, фермент, выделенный из Ba illus subtilis, который, по-видимому, обладает специфичностью, дополняющей специфичность панкреатического фермента (т. е. рибонуклеазы, выделенной из поджелудочной железы). Он катализирует по преимуществу гидролитическое отщепление остатков, соседних с З -пурино-выми остатками. Еще более высокой специфичностью обладают ферменты, выделенные из неочищенных препаратов такадиастазы. Один из них — рибонуклеаза Т1 — катализирует расщепление только тех межнуклеотидных связей, в образовании которых участвуют З -гуаниловые нуклеотиды, а второй — рибонуклеаза Т2 — расщепляет только связи, образованные с участием З -адениловых нуклеотидов. [c.129]

Двумерный электрофорез в полиакриламидном геле может быть также использован для локализации участков ДНК, отвечающих 5 - и З -концевым последовательностям и точкам внут-)имолекулярного переплетения ядерной или вирусной РНК 116]. С этой целью продукт гибридизации РНК и ДНК обрабатывают эндонуклеазой S1, специфичной по отношению к одноцепочечным нуклеиновым кислотам, и полученные гибриды комплементарных фрагментов ДНК и РНК разделяют в соответствии с их размерами с помощью гель-электрофореза. Затем в денатурирующих условиях проводят электрофорез во втором направлении, с тем чтобы определить размер образующихся одноцепочечных фрагментов ДНК. Специфические последовательности обнаруживают с помощью блоттинга по Саузерну и последующей молекулярной гибридизации [116]. Одноцепочечные фрагменты ДНК можно легко разделить с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в щелочной среде. Денатурированные образцы подвергают гель-электрофорезу в буфере, содержащем 30 мМ NaOH и 2 мМ ЭДТА [117]. По своему поведению в этих условиях электрофореза такие фрагменты похожи на одноцепочечные фрагменты РНК (разд. 10.5.2). [c.187]

Для специфического ферментативного расщепления полинуклеотидной цепи используется действие эндонуклеаз. Наиболее широко этот прием применяется для РНК, так как известны два достаточно легко доступных фермента, обладающих ярко выраженной и хорошо охарактеризованной специфичностью, — пиримидил-РНК-аза (панкреатическая РНК-аза) и гуанил-РНК-азы (РНК-аза Т1 из такадиастазы РНК-аза из актиномицетов). Пиримидил-РНК-аза катализирует расщепление фосфодиэфиров нуклеозидов, производных 2-кетопиримидинов, не имеющих заместителя при N-3. При этом получаются соответствующие уклеозид-З -фосфаты или их [c.69]

Для тринуклеотидов строение однозначно вытекает из определения концевых нуклеотидных остатков (см. стр. 44). Строение полинуклеотидов большей длины может быть в некоторых случаях установлено однозначно перекрестным расщеплением эндонуклеазой другой специфичности, как это показано ниже для одного из тетрануклеотидов, выделенного при расщеплении аланиновой тРНК пиримидил-РНК-азой [c.73]

АТФ-зависимые эндонуклеазы — ДНК-специфичные эндонуклеазы, активность которых зависит от присутствия АТФ. Один из этих ферментов получен из т. Шещ действует преимущественно на нативную двухцепочечную ДНК. В продуктах егой еак-ции образуются фрагменты с 5 -монофосфатами на конце. Другой подобный фермент получен из Е. oli. Его особенность в том, что он гидролизует одноцепочечную кольцевую ДНК фага fd. Очищенные препараты этого фермента обладают также экзонук-леазной активностью по отношению к нативной ДНК, причем и для этой активности требуется АТФ. Обе активности связывают с процессами рекомбинации. [c.39]

Нуклеазы — ферменты, катализирующие распад нуклеиновых кислот путем гидролиза фосфодиэфирных связей. Они обнаружены практически во всех биологически объектах. Некоторые из них специфичны только по отношению к РНК (РНК-азы), другие действуют только на ДН К (ДН К-азы). Т ретья группа нуклеаз (неспецифические вуклеазы) проявляет активность по отношению к обоим типам нуклеиновых кислот. Одни нуклеазы расщепляют полимерную цепь нуклеиновой кислоты внутри молекулы (эндонуклеазы), а другие — последовательно расщепляют фосфодиэфирные связи с одного из концов цепи (экзонуклеазы). Известны примеры нуклеаз, выступающих одновременно как эндо- и экзонуклеазы. [c.62]

Определение креатинкиназной активности используется при диагностике некоторых заболеваний. Интересно, что уже в первые часы после инфаркта миокарда в крови резко нарастает содержание креатинкиназы Рибонуклеаза. Различают два основных вида нуклеаз эндонуклеазы и экзонуклеазы. Экзонуклеазы по своему действию относятся к классу гидролаз. Они катализируют реакцию последовательного гидролитического отщепления нуклеотидов от полинуклеотидной цени путем разрыва фосфодиэфирной связи. Эндонуклеазы катализируют расщепление фосфодиэфирных связей внутри молекулы нуклеиновой кислоты, проявляя определенную специфичность к одному из двух типов нуклеиновых кислот в соответствии с этим различают рибонуклеазы и дезоксирибонуклеазы, рассматриваемые в разделе Гидролазы . [c.296]

Смотреть страницы где упоминается термин Эндонуклеаза специфичная: [c.213] [c.489] [c.77] [c.202] [c.27] [c.489] [c.77] [c.165] [c.280] [c.288] [c.14] [c.14] [c.296] [c.77] [c.165] [c.219] [c.451] [c.142] [c.301] [c.747] [c.198] [c.468] [c.7] [c.305]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология