Получение протопластов

В сравнительном плане более подходящим является энзиматический метод получения протопластов как более щадящий. Однако при любом способе важен подбор осмотического стабилизатора, [c.515]

Микроинъекции ДНК. В ряде экспериментов было показано, что метод микроинъекций может успешно применяться для трансформации растительных клеток аналогично микроинъекциям в животные клетки. Это стало возможным после преодоления ряда технических трудностей, в частности, разработки метода получения протопластов для инъекций путем прикрепления их к стеклам полилизином. [c.61]

Получение протопластов из листьев потребовало дальнейшего усовершенствования методики применительно к особенностям этой ткани. Главные отличия методики при работе с листьями заключаются, во-первых, в том, что листовая ткань освобождается от эпидермиса, и, во-вторых, что вместе с пектиназой используется целлюлаза — фермент, разрушающий целлюлозные компоненты клеточной стенки. [c.32]

Для получения протопластов из суспензионных и клеточных культур наилучшей является поздняя стадия логарифмической фазы роста. В этот период клеточные .генки легче всего поддаются энзиматическому разрушению, а протопласты — наиболее жизнеспособны. Выход протопластов зависит от состава среды. Увеличение концентрации ауксина и снижение концентрации сахарозы за 1 сут перед изоляцией протопластов активировало их выход. Полагают, что эти условия влияют на состав клеточной стенки и облегчают ее энзиматическое разрушение. [c.35]

В общем виде способ получения протопластов представлен на рисунке. Однако для каждой системы тканей этот способ требует корректировки. В некоторых случаях бывает необходима предварительная подготовка материала. Так, чтобы получить жизнеспособные протопласты из листьев гаплоидного растения табака, ткань выдерживают в темноте в течение нескольких часов в растворе 0.4 М сахарозы, а побеги и листья бобов помещают на 1 ч в смесь 0.5 М сорбита и 5 10 М СаСЬ, чтобы вызвать предварительный плазмолиз и сократить время инкубации в ферменте. Иногда перед выделением протопластов растение на некоторое время помещают в темноту либо на короткое время на яркий свет. [c.166]

Культура клеток не требует дополнительной стерилизации. Для выделения протопластов используют 2- и 3-суточные суспензии клеток. Однако оптимальный для получения протопластов возраст [c.166]

В общем все методы, которые применяют для выделения хлоропластов, основаны либо на механическом разрушении самой ткаии листа, либо на разрушении в щадящих условиях. тех протопластов, которые были предварительно из нее получены. Такой прием был разработан лишь недавно, и в этом случае для получения протопластов используют ферменты (целлюлаза- -пектиназа), которые растворяют клеточную стенку клеток мезофилла. Для того чтобы получить интактные органеллы, протопласты осторожно разрушают в щадящих условиях. [c.545]

В последние годы достигнуты большие успехи, связанные с генетической трансформацией клеток, в том числе и растительного происхождения. Схема трансформации включает в себя получение протопласта, введение в него необходимой генетической информации, формирование полноценной растительной клетки, клонирование и регенерацию. (Подробно техника генно-и1гженерных экспериментов будет описана в следующем разделе.) В данной схеме трансформированный протопласт — суспензионная культура — каллусная культура — целое растение (рис. 31.4) — наиболее тех- [c.498]

Рис. 9.8. Каллусы образовавшиеся из протопластов Solanum brevidens на агаре. Снимок сделан примерно через месяц после получения протопластов. Для выращивания использована чашка Петри диаметром 9 см.

Выделение, культивирование и слияние изолированных протопластов. Для применения методов соматической гибридизации необходима разработка соответствующих технологий получения протопластов, способных делиться и регенерировать растения. Выделение протопластов растительных клеток путем их плазмолизирования и механического разрушения клеточной стенки было осуществлено еще в конце XIX в. Однако метод изолированных протопластов получил развитие лишь после того, как И. К. Коккинг (1960) впервые осуществил ферментативное разрушение клеточной стенки и выделил голые протопласты. [c.154]

Методы протопластирования применяются для многих микроорганизмов, в том числе и для продуцентов антибиотических веществ. При слиянии протопластов микроорганизмов осуществляются четыре основные стадии 1) образование протопластов в результате лизиса клеточной стенки (для этих целей чаще используют лизоцим) 2) непосредственное слияние полученных протопластов [c.152]

В первичной клеточной стенке на долю основного структурного компонента — целлюлозы — приходится до 30% от сухой массы и столько же на пектиновые вещества, белки и липиды 40% составляют гемицеллюлозы. В клетках разных типов ткани в зависимости от функциональных особенностей, возраста, наличия вторичных утолщений эти соотношения могут варьировать. Например, в клетках из колеоптилей овса клеточная стенка на 25% состоит из целлюлозы, а в молодых волокнах хлопка она составляет 50% от общей массы клеточной стенки (по D. Evans, J. Bravo, 1983). Поэтому комбинации ферментных препаратов и их соотношение специфичны для каждого типа клеток. Наиболее адекватная составу клеточной стенки комбинация обеспечивает успех выделения протопластов. Так, для получения протопластов из плацентарной ткани плодов пасленовых, которые, как правило, имеют высокое содержание пектина, особенно подходящ ферментный препарат пектиназа. Процедура выделения протопластов из плодов состоит из трех этапов 1) обработка ферментом [c.32]

Для получения протопластов широко используют клеточные суспении и каллусные культуры. Схема общей процедуры изоляции протопластов та же. Однако в этом случае нет необходимости в стерилизации исходного материала. [c.35]

Для получения протопластов у микроорганизмов (этот процесс называют протопластированием) используют несколько методов. Одни из них основаны на подавлении синтеза клеточной стенки структурными аналогами ее компонентов и антибиотиками. С этой целью используют пенициллин и фосфомицин или высокие концентрации аминокислот глицина, метионина, треонина и др. Указанные соединения так или иначе нарушают синтез пептидогликана — основного компонента ригидной оболочки бактерий. У дрожжей для получения протопластов применяют 2-дезоксиглюкозу — аналог глюкозы, препятствующий образованию у них клеточной стенки. В настоящее время эти методы в основном утратили самостоятельное значение. [c.124]

Методики выделения протопластов многих видов растений описаны в литературе [26, 32]. На рис. 2.13 представлена общая схема выделения протопластов из растительных тканей. У многих видов культурных растений не определены благоприятные условия для восстановления клеточной стенки и последующего деления выделенных протопластов. В случае других — сообщалось о низкой частоте деления. Отметим, что для трансформации необходимо использовать достаточно жизнеспособные протопласты, чтобы они могли пережить совместное культивирование с агробактериями или физические методы введения ДНК, например микроинъекцию, электропорацию и химически индуцированный эндоцитоз (гл. 3). Напомним, что разработка эффективной системы получения протопластов у ранее неизучен- [c.143]

Процедура получения протопластов 1) листья табака промывают эточной водой, затем споласкивают дистиллированной 2) поме-ют их в стакан с 70 %-ным спиртом на 0.5—1 мин 3) затем [c.173]

Протопласты, изолированные из суспензионной культуры сахарной свеклы, в течение 1-х суток культивирования формируют клеточную стенку на среде Щенка и Хильдебрандта или Као и Михайлюка. Первое деление происходит на 2—3-и сутки. В течение 7—10 сут образуются колонии из 4—8 клеток. Через 2 нед при перенесении образовавшихся клеток на среду Шенка н Хильдебрандта, содержащую 3 % сахарозы, колонии увеличиваются в размерах. Из них можно возобновить суспензию через 30—40 сут после получения протопластов. [c.175]

Для того чтобы исследовать метаболизм углерода, транспорт метаболитов в хлоропластах и компартментацию ферментов в клетке (чему посвящена большая часть этой книги), необходимо прежде всего получить изолированные хлоропласты, которые при этом должны быть интактными, в достаточной степени очищенными от других субклеточных структур и биохимически активными. В некоторых случаях требуется очеиь высокая степень очистки хлоропластов (иапример, для установления локализации тех ферментов, которые присутствуют только в очень небольших количествах), поэтому может оказаться, что гораздо вал<иее освободиться от каких бы то ни было примесей н загрязнений, чем получить хлоропласты, способные осуществлять фотосинтез с очень высокой скоростью. При других обстоятельствах можно поступиться степенью очистки ради сохранения максимального уровня активности, ио наличие примеси цитоплазматических ферментов в препарате может очень усложнить интерпретацию полученных результатов (гл. 8). К тому же важно ие забывать два обстоятельства, которые часто упускают из виду, несмотря на то что это само собой разумеется. Во-первых, абсолютно невозможно получить хорошие хлоропласты из плохого исходного материала (см. разд. А.З). Во-вторых, хорошие хлоропласты будут работать хорошо только тогда, когда с ними будут правильно обращаться. Если оглянуться назад, то станет совершенно ясно, что после того, как в начале 60-х годов в практику были снова введены приемы Хилла, использовавшего в качестве осмотически активного вещества сахара, в плане улучшения методики выделения хлоропластов было сделано очеиь мало, если, конечно, ие считать предварительного получения протопластов (см. разд. А.5). Все последующие улучшения методики, способствующие получению более активных хлоропластов, касались главным образом методики определения активности, и в частности были связаны с введением в среду неорганического пирофосфата (разд. 8.14). [c.543]

Это, пожалуй, первый и чрезвычайно вал<ный фактор, который определяет возможность получения функционально активных хлоропластов. Вполне естественно, что условия, необходимые для оптимального роста различных растений, неодинаковы. В большинстве случаев различная интенсивиость фотосинтеза (и противоречивость сделанных выводов) у одного и того же растения может быть связана с различиями исходного растительного материала у разных исследователей. Так, например, для того чтобы получить хорошие хлоропласты шпината, нул<но обратить особое внимание иа продолжительность фотопериода и на условия питания растения во время его выращивания. Когда хлоропласты выделяют из протопластов, возникает еще одно обстоятельство. При определенных условиях выращиваиия ткань листа может становиться очень устойчивой к действию ферментов, которые переваривают клеточную стенку. При получении протопластов из листьев табака или томатов следует обращать особое внимание на такие факторы, как ос- [c.545]

Для многих целей до сих пор предпочитают использовать шпинат. Это связано, во-первых, с. тем, что в этом растении практически отсутствуют фенольные соединения, которые обычно загрязняют получаемые препараты, и, во-вторых, с тем, что исследованию хлоропластов именно этого растения посвяш,ено. громадное число работ. Еще совсем недавно шпинат был единственным растением (за исключением, пожалуй, молодых листьев гороха), из которого удавалось получать действительно интактные и активные хлоропласты. Для некоторых целей очень удобными оказались растеиия гороха, хотя с каждым годом становится все яснее, что хлоропласты, выделенные из молодых побегов гороха, отличаются по проницаемости от хлоропластов, полученных из взрослых растений шпината. Аврои и др. очеиь широко использовали в своих исследованиях салат ио главным образом для изучения транспорта электронов и фотофосфорилироваиия. Приемы получения протопластов (разд. А.5) позволили выделить хорошие хлоропласты и из миогих других растений. [c.546]

К числу недостатков ферментативного метода получення протопластов можно отнести 1) невозможность применения этого метода для некоторых видов 2) необходимость затрачивать дополнительное время На выделение протопластов (что отнюдь не ограничивает возможность применення этого метода в тех случаях, когда гарантированные результаты оправдывают затраченные усилия) н 3) ограниченный выход органелл (1—5 мгХл на 10 г ткани листа). Сюда же относится и настоятельная необходимость проводить переваривание в теченне минимального времени и использовать для очистки протопластов наиболее подходящий способ. Следует помнить о том, что переваривающие, ферменты могут подавляться различного рода ингибито рам и, а сама обработка ферментами может давать ряд побочных эффектов. [c.557]

При получении протопластов и сфероплас-тов большое значение имеет подбор условий, обеспечивающих в последующем эффективную регенерацию клеточных стенок. Процедуры получения протопластов и сферопластов, трансформации их молекулами ДНК, регенерации клеточной стенки и отбора колоний трансформантов многоэтапны, а результат зависит от многих параметров состава растворов, способов обработки и др. Все это приводит к тому, что данные методики отличаются низкой воспроизводимостью, требуют высокой квалификации исполнителя и весьма трудоемки. Поэтому по мере разработки более простых способов данный подход постепенно утратил свое значение. На смену пришли методы обработки клеток растворами солей (см. 2.1). [c.33]

Генно-инженерные манипуляции на S. erevisiae стали реальны лишь после того, как экспериментально была доказана возможность генетической трансформации дрожжевых клеток. Клеточная стенка дрожжей препятствует проникновению экзогенной ДНК в клетку. Поэтому бьша разработана процедура получения протопластов клеток S. erevisiae. Она состоит в том, что дрожжевые клетки инкубируют в осмотически стабилизирующем растворе, содержащем [c.292]

Принципиально отличающимся методом является ферментативный способ получения протопластов, при котором клеточная стенка удаляется с помощью ферментов. Таким методом уже в 1919 г. были получены протопласты ьслеток грибов в результате обработки их ьслеточных стенок желудочным соком улитки. В микробиологических экспериментах протопласты получались путем разрушения ьслеточных стенок бактерий лизоцимом. Изолирование протопластов растительных ьслеток с использованием ферментных препаратов было осуществлено в I960 г. (Е. o king). По сравнению с механическими способами ферментативные методы получения протопластов имеют определенные преимущества 1) можно одновременно получить большое количество протопластов 2) формирующиеся протопласты не подвергаются сильному осмотическому [c.98]

Иными словами, оптимальные условия дотя получения протопластов растительных ьатеток весьма индивидуальны дотя различных тканей и в каждом случае необходима предварительная работа по подбору состава ферментов, их концентраций и времени обработки. Формирующиеся протопласты должны находиться в контакте с ферментами минимальное время, после чего их необходимо тщательно отмыть. Ферменты, естественно, должны быть стерильными (стерилизация производится, как правило, путем фильтрования через бактериальные фильтры). Важным фактором является подбор осмотического стабилизатора. [c.99]

Смотреть страницы где упоминается термин Получение протопластов: [c.102] [c.515] [c.516] [c.412] [c.96] [c.30] [c.33] [c.19] [c.124] [c.125] [c.125] [c.400] [c.74] [c.236] [c.166] [c.173] [c.546] [c.125] [c.273] [c.98] [c.99]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология