Колонки и буферы

В этой работе вы приготовите и испытаете карбонатный буфер. Вы сравните эффект добавления кислоты и основания к воде и к буферу. Учитель разделит вас на кислотную и основную группы. Прочтите методику и приготовьте таблицу данных. Данные расположите в таких колонках исходный pH, pH после 5 капель кислоты (основания), начальный объем основания (кислоты) в бюретке, конечный объем основания (кислоты) в бюретке, объем добавленного основания (кислоты). [c.459]

В ходе длительной эксплуатации, даже при условии выполнения этих мер предосторожности, верхний слой столба матрицы в колонке может постепенно загрязниться. Его можно удалить так взмутить верхние 1—2 см столба матрицы и отсосать суспензию с помощью водоструйного насоса. Затем следует дополнить колонку буфером или жидкой суспензией геля, взмутить еще небольщой слой матрицы и уравновесить колонку прокачкой буфера, как при первоначальном заполнении. Если загрязнена значительная часть матрицы, колонку лучше набить заново. [c.132]

Снова уравновесьте колонку буфером TBS. [c.130]

Промывайте колонку буфером TBS, содержащим 0,05% (объемная концентрация) твин-20, до достижения постоянной величины поглощения при 280 нм. [c.130]

Нанесите на колонку экстракт, содержащий гибридный белок, при 4 С для уменьшения протеолиза. Промойте колонку буфером PBS (его состав указан в сноске к табл. 5.2) в объеме, равном объему колонки, при 4°С. Все последующие стадии проводите при комнатной температуре. Промывайте колонку буфером BBS-твин (состав указан в сноске к табл. 5.2) до тех пор, пока в элюирующем растворе не останется белка. Уравновесьте колонку буфером PBS. Проведите элюцию раствором, содержащим 4 М гуанидин-НС1, 10 мМ трис-НС1 (pH 8,0), соберите пик и диализуйте его против нескольких смен буфера PBS. Основная часть белка выпадает в осадок и может быть собрана с помощью центрифугирования. Для проведения иммунизации ресуспендируйте преципитат в небольшом объеме PBS и далее следуйте методике, приведенной в разд. 5.4. Сразу же после использования снова уравновесьте колонку PBS. При работе возможно использование и других элюирующих растворов, но более слабые элюенты не смогут разрушить прочные связи комплексов антиген—антитело, и в результате емкость колонки уменьшится, так как большое число участков аффинного связывания окажется занятым. [c.158]

На колонку, содержащую 5 мг -галактозидазы или 5 мл смолы, сшитой с гибридным белком (табл. 5.6), нанесите 10—20 мл антисыворотки. Проводите элюцию PBS и промывайте колонку буфером BBS-твин ) до тех пор, пока с нее не перестанет сходить белок. Уравновесьте колонку PBS. Для обеспечения наиболее полной элюции элюируйте связавшиеся антитела 4 М гуанидинхлоридом. Диализуйте собранный пик против 100 объемов PBS ) как минимум три раза, диализуя раствор против каждой смены буфера не менее трех часов. Снова уравновесьте колонку 3—5 объемами PBS. [c.167]

Промойте колонку буфером, используемым для элюции антигена (таким, как 0,1 М цитрат pH 3,0), Убедитесь в том, что с колонки не сходит белок. [c.203]

Для нахождения оптимальных условий разделения можно менять pH, молярность, скорость потока буфера и температуру колонки. Буферы должны быть приготовлены на воде и из реагентов высокой степени чистоты. Значения рИ устанавливают с точностью 0,001 ед. и растворы буферов хранят под [c.275]

Промывают колонку буфером В ( — 50 мл), пока содержание белка в элюате не станет <0,1 мг/мл. Промывают буфером Г и собирают белковый пик, который должен выходить между 13 и 28 мл. [c.166]

Перед тем как проводить хроматографию, проводят элюцию колонки буфером, который затем будет использован для диссоциации комплексов антиген — антитело. [c.176]

Рис. 4.24. Проведение аффинной элюции. Л. Образец наносят при том же значении pH, при котором проводят элюцию влияние лиганда настолько велико, что величина а уменьшается от >0,95 до очень низкой величины. Б. Образец наносят при рНд, когда а 1,0, затем повышают pH до В, чтобы снизить величину а примерно до 0,9. В результате добавление лиганда оказывает значительное влияние (как показано на рис. 4.23). В. То же, что и на рис. Б, но с подставным> лигандом. На практике подставной лиганд можно использовать, когда начинают промывать колонку буфером с рНв-Заштрихованные пики представляют собой элюированный фермент.

Пропускание раствора через КМ-целлюлозу, промывка колонки буфером с pH 7,5. [c.273]

Поддерживают равномерное умеренное кипение в кубе Колонки и устанавливают необходимую скорость стекания флегмы. Интенсивность кипения регулируют нагревом спирали и подниманием или опусканием бани с жидким азотом в которую -погружен куб колонки, таким образом, чтобы в колонке было атмосферное давление. Скорость стека-ння флегмы регулируют изменением давления водорода й буфере так, чтобы жидкость капала обратно, в куб колонки со скоростью 5 капель в 1 сек.. [c.303]

Решив вопрос о защитной петле, можно освободить зажим на сливной трубке и включить насос для подачи в удлинительную трубку буфера с рабочей скоростью элюции. В таком режиме следует прокачивать буфер до тех пор, пока уровень сорбента не опустится до своего почти окончательного положения в колонке. После этого можно отсоединить насос и дать возможность буферу из удлинительной трубки полностью войти в колонку, а удлинительную трубку (или [c.70]

Короткую колонку (длиной до 20 см) можно набить на "/4 ее высоты без помощи удлинительной трубки. Прямо в колонку можно залить более густую, чем описано выше, кашицу сорбента (1,15 1), затем сразу же ввести адаптор и начать прокачку буфера, в ходе которой сорбент оседает до своего окончательного уровня. [c.72]

Исходный препарат в большинстве случаев вносят на хроматографическую колонку растворенным в том же буфере, каким уравновешена сама колонка. Перевести препарат в этот буфер можно диализом или гель-фильтрацией. Надо проследить за тем, чтобы раствор препарата был прозрачен, т. е. свободен от частиц осадка или пыли. При необходимости его следует осветлить центрифугированием или отфильтровать. [c.77]

Для полного извлечения нуяшого бе.ика экстракт, прошедший через колонку в исходном буфере, после окончания элюции и нового уравновешивания колонки буфером пропускали через нее повторно и элюировали по той же схеме так повторяли 8 раз. В итоге нуж-1[ЫЙ белок ( DB-1 ) из 1 кг яиц дрозофилы получали очищенным в 200 ООО раз. [c.425]

Хроматография на КМ-целлюлозе и кристаллизация. 5 мл 1 М раствора триса доводят сухим MES до pH 6,5 ( 0,1) и добавляют этот раствор в обессоленные белковые фракции с таким расчетом, чтобы конечная концентрация триса составила 10 мМ. Затем раствор белка наносят на колонку (3X4 см) с КМ-целлюлозой, уравновешенную 10 мМ трисом, доведенным сухим MES до pH 6,5 ( 0,1). После нанесения белка на ионообменник колонку промывают 50—100 мл буфера (10 мМ трис-MES, pH 6,5), а затем начинают промывать колонку буфером 10 мМ КОН, доведенный трицином до pH 7,9 ( 0,1) и содержащий 3 М ацетат натрия. Скорость тока через колонку следует установить около 200 мл/ч по мере связывания белка на колонке скорость тока может значительно упасть в этом случае можно увеличить давление, подаваемое на колонку, с помощью перистальтического насоса. [c.264]

При связывании фермента на колонке при pH адсорбции 6,5 в верхней части ионообменника образуется ярко-красное кольцо мышечных белков, а по мере заполнения колонки белком целлюлоза приобретает опаловую, бледную желтизну. Граница раздела между матовой и желтовато-опаловой зонами постепенно продвигается книзу. После подачи на колонку буфера pH 7,9 (КОН-трицин) красное кольцо мышечных белков начинает постепенно двигаться книзу, разделяясь при этом на несколько отдельных колец и прокрашивая целлюлозу в бледно-розовый цвет. Необходимо дождаться выхода этого материала с колонки (для этого через колонку должно пройти 6—10 объемов колонки буфера, pH 7,9). После того как поглощение при 280 нм в элюате снизится до значения 0,1—0,2, на колонку подают буфер (10 мМ КОН-трицин, pH 7,9), содержащий вместо 3 мМ ацетата натрия 0,5 мМ [c.264]

Несколько авторов используют в качестве стандартного метода зонное осаждение на колонке сефадекса G75 или G50. Этот метод, использованный Шутовым и Вайнтраубом [105], усовершенствовали Райт и Боултер [123], а также Шольц и др. [98]. Метод заключается в том, что на колонку, уравновешенную при pH 4,8, помещают смесь глобулинов и элюируют Колонку буфером при pH 7. В этих условиях легумин, изоэлект- [c.153]

Разделение аминокислот методом ионообменной хроматографии. Анализ смеси аминокислот начинают с разделения этой смеси на компоненты методом ионообменной хроматографии. Небольшое количество смеси вносят в вфхнюю часть колонки, заполненной частицами полистирола, содержащими остатки сульфоновой кислоты (см. рис. 5-14). Затем через колонку пропускают буферный раствор. Аминокислоты проходят через колонку с разными скоростями, поскольку их движение тормозят два фактора 1) электростатическое притяжение между отрицательно заряженными остатками сульфоновой кислоты и положительно заряженными функциональными группами аминокислот и 2) гидрофобное взаимодействие между боковыми цепями аминокислот и сильно гидрофобным остовом полистирольной смолы. Для каждой из выписанных ниже пар аминокислот определите, какая аминокислота данной пары будет сходить с колонки первой (т.е. испытывать наименьшее торможение) при пропускании через колонку буфера с pH 7,0. [c.136]

Промывайте колонку буфером с мочевиной до тех пор, пока поглощение элюируемого материала при 280 нм не станет равным нулю, [c.111]

Уравновесьте колонку буфером для нанесения антигена (в случае Т-антигена SV-40 мы используем 20 мМ трис-НС1, pH 8,0, 120 мМ Na l, 1 мМ ЭДТА, 0,1% NP-40). [c.203]

Первая фракция РНК-полимеразы элюируется с колонки буфером В, содержаш им 300 мМ (ЫН4)2504, а вторая — буфером Г, содержаш.им 600 мМ (NH4)2S04. Основные критерии классификации РНК-полимеразы заключаются в чувствительности к сс-аманитину и в порядке элюирования с ионообменников [50]. Первая фракция РНК-полимеразы устойчива к а-аманити-ну при концентрациях до 400 мкг/мл, в то время как вторая фракция ингибируется на 60% при концентрации 0,1 мкг/мл. Со- [c.169]

IX. Когда культура по вашим оценкам достигнет полного монослоя, отключите перфузионную систему, удалите из колонки среду, промойте колонку буфером и добавьте смесь трипсин-—версен (или проназы и т. п.) в количестве, равном свободному объему колонки оставьте на 15—30 мин. Сбор клеток может быть ускорен сливом трипсина и обратным добавлением в колонку. Другим способом ускорения сбора клеток может служить пробулькивание газа через колонку (с очень низкой скоростью во избежание смещения бус и повреждения клеток). [c.85]

Проводят элюцию 1М пропионовой кислотой. По мере элюирования определяют оптическую плотность фракции во фракциях с наибольшим содержанием антител может появиться помутнение. Препарат следует немедленно нейтрализовать сухим трисом. После элюции вновь уравновешивают колонку буфером трис/150 мМ Na l. Если не предполагается получать из антител Р(аЪ )2-фрагменты, то элюат просто диализуют против буфера трис/150 мМ Na l или другого, выбранного буфера. Количество чистого IgG, элюируемого с колонки, насыщенной антителами, приблизительно равно количеству иммобилизованного IgG. [c.170]

Значение pH в микроокружении ионообменника отличается от его значения в наносимом на колонку или вытекающем из колонки буфере, так как протоны вну11ри матрицы адсорбента могут отталкиваться или притягиваться за счет эффекта Доннана. В общем pH матрицы бывает обычно на 1 единицу выше, чем рН окружающего буфера, в анионообменнике и на 1 единицу ниже — в катионообменнике (рис. 4.11). Чем ниже ионная сила буфера, тем значительнее эта разница. Такое явление имеет очень важные последствия, когда речь идет о стабильности фермента в зависимости от pH. Фермент, стабильный при pH [c.112]

Теперь образец белка растворен в подходящем для нанесения на ионообменную колонку буфере. Единственное, что остается сделать, это довести концентрацию белка до нужной величины. Даже после удаления солей и других манипуляций концентрация белка может достигать 30 мг-мл . Это очень высокая концентрация, особенно если на ионообменнике адсорбируется значительная часть белка. Ионы буфера вовлекаются в ионный обмен, и быст рое замещение противоионов молекулами белка может привести к резкому локальному изменению pH и концентрации соли (разд. 4.2). Любые тщательно подбираемые условия должны быть воспроизводимыми вместе с тем, хотя нанесение образца с высокой концентрацией белка иногда дает хорошие результаты в том или ином конкретном случае, воспроизводимость может оказаться низкой. Часто условия, хорошо воспроизводимые при повседневной работе в одной ла-борато рии, очень трудно воспроизвести в другой. Поэтому лучше пользоваться методами, не очень сильно зависящими от точ- [c.123]

Для ПОЛНОГО выделения цинка требуется пропустить через колонку около 50 мл 2М НС1. Вытекающий из колонки раствор собирают в коническую колбу для титрования, к полученному раствору добавляют 30 мл аммиачного буфера титрование ведут стандартным раствором ЭДТА в присутствии эриохрома черного Т до перехода окраски из винно-красной в синюю. Рассчитывают массу цинка в анализируемом растворе. [c.103]

Между дефлегматором 2 с жидким азотом и камерой стока флегмы а верхней частя колонки находится буфер 4, который во время ректафнкацви наполняют водородом. Назначение буфера — регулирование скорости стска-ния флегмы путем наменевия условий передачи тепла в результате изменения давлення водорода в буфере. [c.302]

Когда в головке колонки сконденсируется достаточное количество флегмы и колонка будет полностью смочена стекающей флегмой, поддерживают равномерное, умеренное кипение в кубе колонки и устанавливают необходимую скорость стекания флегмы. Интенсив-йость кипения регулируют нагревом спирали и подниманием или опусканием бани с жидким азотом, в которую погружен куб (КОЛОНКИ, таким образом, чтобы в колонке было атмосферное давление. Скорость стекания флегмы регулируют изменением давления водорода й буфере так, чтобы жидкость капала 01братн0 в куб колонки со скоростью 5 капель в 1 сек. [c.301]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология