Гель-хроматография на колонке с сефадексом

Обратимые реакции с низкомолекулярными соединениями характерны не только для ферментов, но также и для белков сыворотки. Здесь особый интерес представляют исследования по связыванию сывороточными белками фармацевтических препаратов и металлов (см. литературу, приложение III). Описанные в литературе опыты по качественному и количественному изучению таких комплексов также свидетельствуют о том, что гель-хроматография оказалась полезной и в этой области. В некоторых экспериментах сухой сефадекс вносили в раствор обоих компонентов. Сочетание в этих опытах гель-фильтрации с центрифугированием (см. гл. II), несомненно, позволило бы получить еще более точные результаты. На колонках изучалось взаимодействие триптофана и некоторых его производных с сывороточным альбумином, при- [c.148]

Определение молекулярной массы белков методом ультрацентрифугирования требует много времени и сложной и дорогостоящей аппаратуры. Поэтому в последние годы разработаны два более простых метода (гель-хроматография и электрофорез). При использовании гель-хроматографии в первую очередь требуется откалибровать колонку. Для этого через колонку с сефадексом пропускают несколько белков с известными молекулярными массами и строят график, откладывая значения логарифмов молекулярной массы против их элюционных объемов, которые находят, как показано на рис. 1.9. [c.45]

В гель-хроматографии применяются наполнители различных марок, отличающиеся размером пор. При использовании в качестве наполнителя, например, сефадекса марки 0-50 для разделения фракций поли-21Тиленгликоля Н(-СНОН—СНг—),,0Н первыми будут выходить из колонки фракции с относительной молекулярной массой больше 10 000 (/< =0). Последними будут выходить фракции полимера с молекулярной массой, меньше 500, и в их числе часто присутствующие минеральные соли (ЫаС1 и др.), для которых К = Таким образом, с помощью се( )адекса 0-50 могут быть разделены фракции полиэтилеигликоля с молекулярной массой в области 500—10 000. [c.59]

Молекулярно-ситовая хроматография. При данном виде хроматографии используется способность материалов с контролируемой пористостью сортировать и разделять компоненты смеси в соответствии с размерами и формой их молекул. Для осуществления процесса гель-хроматографии используются гели поперечно-емкостного декстрана (сефадексы и сефакрилы), поперечно-сшитые полиакриламидные гранулы (биогели), агарозные гели с выраженными в них цепями акриламидного полимера (ультрагели) и более жесткие поперечно-сшитые агарозы (СЬ-агарозы и сефакрилы-8), с помощью которых можно быстро разделить макромолекулы в соответствии с их размером. Степень удерживания растворенного вещества на колонке зависит от его способности проникать в поры геля. Поэтому при гель-фильтрации сначала выходят высокомолекулярные вещества, а затем вешества в порядке убывания их моле- [c.55]

Для фракционирования нуклеозидов можно использовать продажные гель-фильтрующие материалы Сефадекс G10 и G15 и Биогель Р2. Преимущества этих материалов в том, что элюируемые вещества не размываются по колонке, количественно снимаются с колонки и нет необходимости применять солевые градиенты. Также маловероятно, что в условиях гель-фильтрации будут протекать какие-либо химические процессы деградации лабильных нуклеозидов, т. е. что-либо похожее на процессы, обязательно происходящие при ионообменной и адсорбционной хроматографии. 127]. [c.74]

По данным гель-хроматографии строят график зависимости = рассчитывают Уо, зная массу сухого сефадекса в колонке, и, воспользовавшись данными табл. 3.2, приведенной выше, рассчитывают число теоретических тарелок N. ВЭТТ и Кау ДЛЯ щавелевой кислоты по уравнениям (3.2) — (3.4), (3.22). [c.243]

ГЕЛЬ-ХРОМАТОГРАФИЯ НА КОЛОНКЕ С СЕФАДЕКСОМ [c.176]

Гель-хроматография. В препаративных целях, особенно при очистке белков от примесей, щироко используют метод молекулярных сит, или гель-хроматографию. При обработке эпихлоргидрином полисахарида дек-страна образуются различной степени выраженности поперечные связи, приводящие к формированию крупных гидрофильных зерен, нерастворимых в воде и называемых сефадексами. Благодаря большому сродству к воде зерна сильно набухают в водной среде с образованием геля, которым заполняют хроматографическую колонку. Разделение веществ этим методом основано на том, что большие молекулы не проникают во внутреннюю водную фазу геля, являющуюся стационарной, и остаются снаружи, двигаясь вместе с подвижной фазой вниз вдоль колонки небольшие молекулы, напротив, свободно диффундируют внутрь зерен, образуя равновесную систему между подвижной и стационарной фазами, и соответственно с меньшей скоростью двигаются вдоль колонки (рис. 1.5). Обычно момент появления веществ в вытекающем из колонки с сефадексом элюенте выражают формулой [c.30]

Рис. 1.5. Гель-хроматография на колонке с сефадексом (схема).

Центральной задачей при получении олигосахаридов почти из любого источника является выделение индивидуальных соединений из смеси моно- и олигосахаридов. Для этой цели разработано несколько методов, основанных на хроматографии . Наиболее старым из них является распределительная хроматография на целлюлозе . Для элюирования обычно используют системы растворителей, аналогичные тем, которые применяются для бумажной хроматографии сахаров (см, гл, 14), Этот метод позволяет осуществлять вполне удовлетворительное разделение, однако характеризуется малой емкостью колонок и требует довольно много времени. Более эффективна адсорбционная хроматография на смеси угля и целита (см., например, " ). С таких колонок моносахариды обычно элюируются водой, а олигосахариды элюируются в порядке возрастания степени полимеризации водно-спиртовыми смесями с увеличивающейся концентрацией спирта. В последние годы такой метод стал основным способом разделения смесей олигосахаридов. Смеси высших олигосахаридов хорошо разделяются гель-фильтрацией на сефадексе Г-25 . Однако для низших олигосахаридов (степень полимеризации 2—4) этот способ мало эффективен . [c.425]

Эккере [33] применил этот принцип к гель-хроматографии и предложил для очень пористых гелей механизм ограниченной диффузии. (В отличие от других типов геля для сефадекса 0-200 коэффициент распределения между фазой геля и элюентом в равновесном состоянии значительно отличался от значения Кв., определенного на колонке.) Согласно новому принципу, объемы выхода макромолекул (белков) с гранулированного геля агара или сефадекса 0-200 определяются скоростью их диффузии в фазу геля. Вследствие медленной диффузии крупные молекулы проникают в гель не столь глубоко, как мелкие, н поэтому вымываются с колонки гораздо раньше. Вновь применив уравнение Ренкина [32], Эккере связал величину /(( , характеризующую поведение макромолекул в геле, с величиной г Я, где г — радиус частиц белка [c.120]

Гель-хроматография на сефадексе LH-20 в системе хлороформ— метанол — гексан оказалась особенно эффективным методом выделения каротиноидов из их смеси со стероидами [365, 366]. Для отделения каротинов от растительных белков и от других пигментов можно использовать ионообменную хроматографию на DEAE-целлюлозе в 0,5 М растворе хлорида натрия [367]. В работе [368] описан модифицированный вариант обычного метода анализа каротинов и ксантофиллов, предусматривающий периодическое обновление смеси силикагеля 60 и хайфлосуперцела [368]. Время разделения на новой колонке составляет 30 мин, причем ее можно использовать четырежды. [c.249]

Примером может служить применение гель-хроматографии для диагностики заболеваний щитовидной железы. В этом случае используется избирательное сродство трииодтирозина к сефадексу. Предварительно сыворотку инкубируют в стандартных условиях с гормоном, меченным радиоактивным иодом, затем хроматографируют на колонке с сефадексом. Растворителем служит вода. В результате получают три ника пик связанного с белком гормона, пик свободного гормона и между ними пик радиоактивного иода, образовавшегося при фотохимическом разложении гормона. Диагноз устанавливают по количеству иода, т, е. по величине пика. [c.233]

Очень часто нужно решать задачи, связанные с разделением сульфонатов лигнина. Эти вещества могут выделяться в чистом виде из сульфитного щелока (отработанного) посредством обработки его трихлоридом гексамминкобальта и превращением его в бариевые соли на ионообменной колонке [41]. Используя сефадекс 0-75 и 0-100, можно получить фракции с молекулярными массами вплоть до 100 000. Механизм разделения лигно-сульфонатов кальция и лития с помощью гель-хроматографии был исследован на колонке, наполненной сефадексом 0-25 и 0-50, при использовании в качестве элюента воды, смеси диок-сан—вода и водных растворов хлоридов кальция и лития [42]. [c.57]

За последние годы широкое применение для разделения высокомолекулярных веществ и определения их молекулярной массы нашел предложенный Л. Поратом и П. Флодином метод гель-фильтрации (гель-хроматографии). Гель-хроматография состоит в фильтровании исследуемого раствора через колонки, заполненные зернами набухающего трехмерного полимера (сефадекса). Набухшие зерна сефадекса представляют собой своеобразные клетки , внутрь которых могут проникнуть путем диффузии только молекулы (ионы) подходящего размера. Более крупные молекулы проходят с фильтрационным потоком мимо зерен сефадекса (рис, 10.8). Набор различных марок сефадексов с возрастающим размером клеток позволяет отделять низкомолекулярньк вещества от высокомолекулярных, разделять макромолекулы, изучать образование ассоциатов в макромолекулярныхрастворах. [c.299]

Для очистки мембранной D-лактатдегидрогеназы Е. соИ хроматографией на оксиапатите [Pratt et al., 1979] был использован пологий линейный градиент концентрации (0—0,2 М) К-фосфатного буфера, pH 7,2 (500 мл для колонки размером 2,6 X 20 см). Растворимость белка обеспечивали включением в состав буфера детергентов (1% Тритона Х-100 и 0,1% ДДС-Na). Очистке на оксиапатите предшествовали освобождение фермента из ме.мбрин с помощью дезоксихолата натрия, хроматография на DE-52 и гель-фильтрация на сефадексе G-200. На всех хроматографических этапах очистки в составе элюентов тоже присутствовали детергенты. [c.234]

Гель-хроматография. Полученный раствор наносят на колонку с сефадексом G=100 (2,5x100 см). Уравновешивание колонки и элюцию осуществляют тем же буфером. Фракцию фермента разливают на порции и хранят при —70° С. [c.231]

В настоящее время имеется ряд новых методов определения молекулярного веса, которые могут соперничать с ультрацентрифугированием. Один из них — это простая гель-фильтрация. Колонку тщательно заполняют гелем (например, сефадексом) и калибруют, пропуская ряд белковых растворов. Измеряют Уе — объем элюата, собранного с момента нанесения вещества на колонку до момента его выхода из колонки, и делят этот объем на Уо — объем элюата для очень крупных частиц, совершенно не проникающих внутрь частиц геля. Далее строят зависимость Уе/Уо ОТ логарифма мол. веса для ряда белков с известным молекулярным весом. Как и при оценке молекулярных весов по константам седиментации, здесь предполагается, что молекулы всех белков имеют примерно сферическую форму для неизвестного белка значение молекулярного веса определяют по местоположению отвечающей ему точки на описанном выше графике [153, 154]. Модификацией этого метода служит хроматография при высоких концентрациях гуанидинхло-рида — соли, вызывающей денатурацию белков. Предполагается, что в таком растворителе белковая молекула представляет собой статистический клубок [154]. [c.182]

Разновидностью метода фракционирования на колонке является гель-хроматография [86]. В качестве разделительного вещества применяют органические или неорганические вещества (например, силикагель) пористой структуры с размером пор, зависящим от плотности сшивок и условий получения. Для фракционирования полимеров, растворимых в воде, чаще всего применяют набухший в воде декстран с различной степенью сшивания (сефадекс). Для растворов полимеров в органических растворителях применяют сшитые полистиролы или сополимеры метилметакрилата с этилен-гликольдиметакрилатом. Образец полимера растворяют, заливают в колонку и элюируют, используя тот же самый растворитель. Небольшие молекулы полимера свободно диффундируют внутрь геля. Размеры некоторых молекул оказываются настолько большими, что им не удается проникнуть внутрь пор, в результате чего они первыми выходят из колонки при элюировании. Продолжительность элюирования фракций возрастает с уменьшением размера макромолекул. Существует критическое значение молекулярной массы, ниже которого макромолекулы полимера могут проникать в поры сетки и поэтому могут быть разделены. Молекулы большего размера уже не могут быть разделены, так как они не могут диффундировать в гель. Частота сетки геля и критическое значение молекулярной массы связаны между собой простой зависимостью чем чаще сетка, тем меньше критическое значение молекулярной массы. [c.83]

Сефадексы используют в качестве молекулярных сит при жидкостной хро-) матографии методом гель-фильтрации (синонимы гель-хроматография, гель-проникающая хроматография, молекулярно-исключакщая хроматография, экс-клюзиониая хроматография). Вещества с размерами молекул больше, чем размер пор геля, проходят через колонки с сефадексами без проникновения внутрь частиц геля, и элюируемый объем равен свободному, т. е. не занятому частицами геля объему колонки (обычно 38—42%). Мо/.екулы размером меньше, чем размер пор геля, будут проходить через зерна геля по этим порам, и в результате увеличения сечения колонки, проницаемого для таких молекул, их движение по колонке будет более медленным (элюируемый объем таких веществ будет больше свободного объема колонки). Другими словами, скорость движения отдельных веществ в колонках связана с коэффициентами распределения этих веществ между гелем и данным элюирующим раствором, чем больше коэффициент распределения, тем медленнее элюирование и тем больше величина элюируемого объема. [c.161]

Этот гель декстрана является в настоящее время наиболее широко распространенным носителем для гель-хроматографии. Выпускаются восемь типов сефадекса, различающихся по степени набухания (табл. 5). Области применения сефадексов различных типов определяются их пористостью и в значительной мере перекрываются между собой. Каждый тип сефадекса, выпускаемого в виде небольших шариков, подразделяется на несколько фракций. Сверхтонкая фракция предназначается главным образом для тонкослойной хроматографии (см. стр. 84), однако ее можно применять и для хроматографии на колонке, причем в этом случае достигается очень тонкое разделение. Среднюю и тонкую фракции предпочтительнее использовать для обычного препаративного разделения, т. е. там, где скорость протекания не должна быть слишком низкой. Сефадексы G-25 и G-50 выпускаются также в виде грубой фракции, которая предназначается для исследований с применением центрифугирования, а также для хроматографии на препаративных колонках. [c.47]

Гель-фильтрация на Сефадексе 0-50, изоэлектрофокусирование на колонке, хроматография на Сефадек-се 0-200 и ДЕАЕ-сефадексе [c.124]

Все применяемые в гель-хроматографии наполнители колонок традиционно делят на мягкие, полужесткие и жесткие гели [101]. Емкость геля может быть охарактеризована отношением У /У , которое лежит в диапазоне от 0,5 для жестких гелей до 2-3 для мягких гелей. Для мягких гелей характерна, с одной стороны, высокая эффективность и емкость при низких скоростях потока, с другой — высокая степень набухаемости в водных средах и увеличение объема пор при набухании. Соответственно повышение скорости подвижной фазы вызывает деформацию мяг-Ю1Х гелей. Они сжимаются, снижается их емкость. Из коммерческих мягких гелей для гель-фильтрации чаще всего применяют декстрановые гели, названные сефадек-сами. Сефадексы — гранулированные поперечно-сшитые декстраны (полисахариды), имеющие в набухшем состоянии гелевую структуру, обладают сильными гидрофильными свойствами. Неионообменные сефадексы содержат все же небольшое количество гидроксильных групп, определяющих адсорбционную емкость сефадексов порядка [c.209]

Наиболее широко используется гель-хроматография жирных кислот в анализах полимеризованных масел. Так были разделены ненасыщенные жирные кислоты, метиловые эфиры и соответствующие спирты жирного ряда, начиная от их мономеров и вплоть до пентамеров [32] (рис. 26.1.). Авторы использовали колонки размером 2300x20 мм или 1000x15 мм, наполненные сефадексом ЬН-20, который перед наполнением был оставлен набухать в диметилформамиде в качестве детектора использовался дифференциальный рефрактометр с помощью диметилформамида [c.193]

В работах [88, 89] использован метод гель-проникающей хроматографии на сефадексе 0-25 (колонка 38X1,8 см) с применением дистиллированной воды в качестве элюента для разделения растворимых в воде производных эстрогенов. [c.235]

При разделении защищенных нуклеозидов, например ано-мерных рибофуранозилпроизводных урацила, в качестве сорбента с успехом используют нейтральную окись алюминия, а в качестве элюента — смеси бензола и этилацетата в разных пропорциях [44, 45, 84, 85]. В табл. 37.6 приведены значения Ка основных нуклеозидов на колонке с сефадексом на основании этих данных можно оценить возможность разделения той или иной смеси методом гель-проникающей хроматографии при использовании элюентов различного состава [47, 48, 67—69]. Хорошие результаты дает разделение на обычных или специально фракционированных биогеле Р-2 [86, 87] и сефадексе 0-10 [88]. Показано, что эти два геля можно использовать для определения нуклеотидного состава нуклеиновых кислот (рис. 37.11). Биогель Р-2 применяют также для разделения нуклеозидов в присутствии большего количества нуклеотидов, которые в этом случае элюируются существенно быстрее, чем на сефадексе 0-10. Хроматографию на биогеле Р-2 или сефадексе 0-10 неоднократно использовали в качестве микроаналитического метода при определении нуклеозидного состава энзиматических гидролизатов ДНК [89—91] и идентификации концевых нуклеотидов [92]. Смесь рибо- и дезоксирибонуклеозидов разделяли на колонке с фракционированным биогелем Р-2 в буферном растворе (pH 10,1), содержащем тетраборат натрия (рис. 37.12) [87]. Для отделения тимидина от 5-бром- и 5-иоддезоксиуридинов предложено проводить хроматографию на сефадексе 0-10 в фос-фатноцитратном буферном растворе с pH 3,5 [93, 94]. [c.53]

Пигменты вина выделяли гель-фильтрацией на сефадексе G-25 в водно-спиртовой НС [86] или в водном ацетоне [87]. Полимерные фракции легко отделялись в виде узкой зоны, однако ввиду сильной адсорбции полного разделения антоцианов не достигли. Хорошее разделение антоцианов получено при распределительной хроматографии на сефадексе в системе -бутанол—уксусная кислота—вода (4 1 5) [88]. При работе в препаративных масштабах этому методу свойственны те же недостатки, что и хроматографии на порошкообразной целлюлозе. Антоциан, полученный при диализе пигмента ирИса Prof. Blaauw , был очишен на сефадексе LH-20 (колонка 1,5x30 см) в подкисленном метаноле (1% НС1) при скорости подачи 1 мл/мин [89]. [c.131]

Рис. 45.2. Разделение методом гель-хроматографии на колонке (1,0X39 см) с сефадексом G-10 пенициллинов, 6-АПК и продуктов деградации 6-АПК [12].

Такой детектор регистрирует минимальные тепловые эффекты, имеющие место при взаимодействии растворенного вещества с сорбентом. Измерения проводятся в специальной детекторной колонке, расположенной непосредственно после главной рабочей колонки. Однако кажется сомнительным, чтобы этот остроумный принцип оказался приемлемым для гель-хроматографии, поскольку, согласно доминирующим воззрениям относительно механизма происходящих в колонке процессов, вещества с гелем не взаимодействуют (см. гл. П1). Тем не менее при разделении на сефадексе G-10 олигомерных полисахаридов и про-пиленгликолей их удалось надежно определить в элю-ате с помощью детекторной колонки [49] приборы такого типа выпускаются фирмой Bio- al (Mun hen, BDR). [c.67]

Гель-хроматографию особенно целесообразно применять в тех случаях, когда необходимо очень быстро отделить высокомолекулярные компоненты от низкомолекулярных. На специально подготовленной колонке (3X6 сл) с сефадексом 0-25 (грубым) Эрлан-деру [25] удалось всего за 2 мин полностью отделить рибонуклеазу от воды, содержащей тритий. Этот быстрый аналитический метод позволяет изучить кинетику обмена трития и на этом основании сделать выводы о степени спирализации растворенного белка. Несколько позднее аналогичная методика была успешно использована при исследовании вторичной структуры растворимых рибонуклеиновых кислот [26] и дезоксирибонуклеиновых кислот [27]. Конечно, нуклеиновые кислоты также могут быть модифицированы химическим путем, например действием диазотированной сульфаниловой кислоты [28]. Избыток реагента и побочные продукты реакции удаляют на сефадексе 0-50. [c.146]

С помощью гель-хроматографии уже давно уда лось установить наличие ассоциатов в некоторых белковых препаратах. Педерсен [96] на сефадексе G-150 выделил и охарактеризовал чистый димер из старых препаратов сывороточного альбумина. Компоненты, выходящие с колонки еще раньше, представляли собой тример и тетрамер сывороточного альбумина (см. [163]). После того как чистую рибонуклеазу А в 50%-ной уксусной кислоте лиофилизировали, а затем фракционировали на сефадексе G-75, в элюате было обнаружено несколько активных фракций. Главный пик соответствует исходному мономеру белка, тогда как остальные компоненты, судя по объемам выхода, являются ассоциатами [97]. Очевидно, аналогичное явление образования димера и других полимеров обна> ружили Зигель и Монти [98] при исследовании уре-азы. Хроматографией на сефадексе G-200 им удалось из кристаллического фермента (Sigma, тип С 1) выделить несколько более быстро движущихся фракций. На основании объемов выхода для них с помощью уравнения Эккерса [59] был вычислен радиус по Стоксу это дало возможность определить молекулярный вес. Таким образом был установлен чрезвычайно интересный факт из препарата, помимо уреазы (мол. вес 483 000), удалось выделить ее димер и тример. По-видимому, в свободном объеме элюировались также продукты еще более высокой степени агрегации. [c.175]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология