Приготовление образцов ДНК для электрофореза

Вторичную структуру РНК можно разрушить еще в ходе приготовления образца для гель-электрофореза. Этого можно достичь с помощью ряда методов, в том числе путем обработки РНК 1,1 М формальдегидом [91—93], метилртутью [94] или 1 М раствором глиоксаля в 50%-ном водном диметилсульфоксиде при 50 °С [95, 96] (рис. 10.8). Эти реагенты обратимо взаимодействуют с пуриновыми и пиримидиновыми основаниями, что [c.179]

ДНК, подвергаемая частичному гидролизу, должна быть достаточно высокомолекулярной (>1000 т.п.н.). Методика приготовления образцов ДНК та же, что и для пульс-электрофореза [10, 11], с той лишь разницей, что количество ДНК рассчитывается для препаративных целей. [c.101]

Приготовление образцов ДНК для электрофореза [c.200]

ЛИЗ, в) электрофорез и г) измерение вязкости разбавленного раствора в присутствии вязких электролитов. На основании этой работы было найдено, что степень полимеризации соли Курроля зависит, как показано в табл. 4, от температуры приготовления и времени нагрева образца. [c.54]

Готовят агарозный гель, например 1,2%-ный, для разделения РНК длиной 2000—5000 нуклеотидов. Для приготовления геля используют 1,2 г агарозы, 10 мл 10Х буфера, 16,7 мл 36—37%-НОГО формальдегида и 73,3 мл воды. Образцы наносят на гель и проводят электрофорез в 1х буфере до выхода оранжевого G из геля. Окрашивание проводят, как описано в разд. 4.4.1. [c.40]

Оборудование 1. Центрифуга типа УЦП-60. 2. Термостат на 37 °С. 3. Мешалка магнитная. 4. Эксикатор с краном (вакуумный). 5. Посуда и реактивы, необходимые для приготовления белковых образцов для электрофореза. [c.259]

Для приготовления образца смешивают в маленькой пробирке 3 мкл красителя (0,05%-ного раствора бромтимолового синего), 1 каплю глицерина, 5 мкл р-меркап-тоэтанола и 50 мкл раствора А (см. ниже). Затем добавляют 10—50 мкл раствора белка, смесь перемешивают и наносят на поверхность геля. Раствор А, разбавленный в соотношении 1 1, осторожно наслаивают на образец до самого верха пробирки. Электродные сосуды заполняют буфером раствора А, разбавленным в два раза. Используют трубки размерами 10 смХб мм [80]. Электрофорез проводят при постоянном токе, причем сила тока составляет 8 мА на 1 трубку. Разделение продолжается в течение 4 ч. После электрофореза гели из- [c.273]

Разрушение антигенных детерминант, которое, вероятно, и препятствует взаимодействию моноклональных антител с белками на блоте, может быть вызвано совместным действием целого ряда факторов. Это, в первую очередь, присутствие детергентов, хаотропных агентов, мочевины, а также действие протеаз, механические или тепловые повреждения, т. е. те факторы, которые могут влиять на белки в ходе приготовления образцов и собственно электрофореза. Нарушение структуры отдельных детерминант может происходить также и во время [c.353]

Приготовление слоя силикагеля согласно работе [145]. Стеклянную пластинку (200X80 мм) тщательно промывают этанолом. На края пластинки приклеивают полоски фильтровальной бумаги (например, ватман № 1) размером 80X65 мм, которые для улучшения притока буферного раствора имеют продольные разрезы. Клей наносят только в отдельные точки, чтобы буфер мог равномерно проходить через полоски бумаги. Из 4,5 г силикагеля G и 8 мл 3%-ного раствора борной кислоты готовят суспензию, наливают ее на пластинку и разравнивают, причем слой силикагеля должен покрыть и участки бумажных полосок, приклеенных к краям пластинки. Слой высушивают 25 мин при комнатной температуре. Толщина слоя составляет около 0,4 мм. После фиксирования на пластинке места старта и нанесения образца последующие операции производят согласно обычным методикам, применяемым в электрофорезе. По окончании разделения полоски бумаги отрезают, слой высушивают и проводят обнаружение. Та же методика используется и при работе со слоями из кизельгура. [c.161]

Если количественный перенос вещества не является необходимым, тонкие однородные образцы можно приготовить одним из методов, описанных в разделе, посвященном способам приготовления мишеней напылением в вакууме, электроосаждением, методами электрофореза или электрораспыления [1, 2, 26]. Напыление путем испарения с накаленной проволоки можно использовать для прдготовления образцов из большинства элементов. В некоторых случаях процесс можно проводить даже на воздухе например, при нагревании таких летучих элементов, как полоний или астатин, их можно сконденсировать непосредственно на подложке, расположенной над нагреваемым объектом. В большинстве случаев используют простые вакуумные установки. Применение установок с хорошо продуманной конструкцией испарителя и приемника позволяет производить перенос радиоактивного вещества преимущественно в заданном направлении и, таким образом, избежать потерь. Конденсацию вещества можно проводить даже на тонкой полимерной пленке, если в условиях напыления она не разрушается теплом, исходящим от накаленной проволоки. При использовании метода напыления желательно сначала нагреть проволоку до температуры несколько более низкой, чем необходимая для испарения наносимого материала. Таким образом избавляются от летучих примесей и только после этого помещают подложку образца в нужное положение и доводят температуру до необходимого уровня. Специальные методы получения тонких радиоактивных препаратов разработаны для тех случаев, когда соответствующий изотоп образуется в ходе радиоактивных превращений, в особенности при а-распаде. В этом случае энергию отдачи ядра, образующегося приа-распаде, используют для отделения дочернего продукта от исходного вещества и для его переноса на расположенную рядом пластину-коллектор. Аналогично энергию отдачи можно использовать для перенесения продуктов ядерной реакции из тонкой мишени на фольгу-коллектор, расположенную по ходу пучка, выходящего из облучаемой мишени. Такого рода методы особенно широко используются при исследовании короткоживущих изотопов трансурановых элементов, образующихся при облучениях на ускорителе. [c.411]

Приборы и методы, используемые при изучении генетической изменчивости в природных популяциях с помощью электрофореза в геле, изображены на рис. 22.7. Образцы тканей разных организмов гомогенизируют (измельчают) для освобождения из клеток ферментов и других белков. Пробы надосадочных жидкостей (растворимых фракций), полученных при центрифугировании гомоге-натов, наносят на гель, приготовленный из крахмала, агара, полиакриламида или какого-нибудь другого желеобразного [c.86]

Электрофоретическое разделение исследуемых веществ можно также осуществлять на пластинах полиакриламидного геля размерами ЮОХЮО мм при толщине слоя геля от 1 до 3,5 мм. Пластины с углублениями для внесения образцов приготавливают на особых подставках. Для проведения электрофореза требуется специальное оборудование. Конструкция прибора позволяет устанавливать пластины в вертикальное положение при этом канавки для образцов должны быть расположены у верхнего края пластины и контактировать с верхним буфером, тогда как противоположный край пластины должен находиться в контакте с нижним буфером. Необходимо обеспечить циркуляцию охлаждающей жидкости по поверхности пластины с обеих ее сторон. Основное достоинство этой системы заключается в том, что она позволяет проводить одновременное разделение нескольких образцов в одинаковых условиях, благодаря чему их легко можно сравнивать между собой. Считается, что пластины легче анализировать с помощью денситометра, однако для этого необходимо иметь специальный прибор. Кроме того, пластинки можно без особого труда разрезать на полоски и проанализировать их на наличие различных компонентов путем окрашивания или определения радиоактивности. Полоски можно также высушивать и хранить. Однако для приготовления пластин требуется больше акриламида, особенно если анализируется немного образцов. Как и в случае электрофореза в трубках, для данного метода разработан целый ряд однородных и неоднородных ( прерывистых ) буферных систем. Здесь применяются те же способы приготовления гелей, методики разделения и анализа, что и при электрофорезе в трубках. [c.265]

НОЙ воды и остатки разрушенных клеток удаляют с помощью высокоскоростного центрифугирования. Описанная методика приготовления растворов гемоглобина для электрофореза довольно проста и позволяет получать гемолизаты, свободные от лейкоцитов и тромбоцитов. Однако массовые обследования требуют максимально простых и быстрых методов. Для этой цели была предложена упрощенная методика с использованием центрифугирования в смеси сахарозы и детергента [1158]. Она дает хорошие результаты, но не позволяет получать гемоглобин Н (П. Кингстон, личное сообщение, цитируемое Хунцманом [598]). Некоторые авторы используют образцы цельной крови для электрофореза гемоглобинов на ацетате целлюлозы. Лизис клеток осуществляют, включая лизирующий агент либо в образец крови, либо в буфер, которым пропитывают пленку ацетата целлюлозы [343, 437]. Образцы крови можно также высушивать на фильтровальной бумаге и помещать эти бумажные полоски на ацетат целлюлозы [532]. Шнейдер и др. [1143] применяли лизирующий реагент (содержавший в 1 л 2,5 г ЭДТА и 50 кг K N) для лизиса неотмытых эритроцитов. Гемоглобин, подвергаемый электрофорезу, может использоваться в виде оксигемоглобина, карбоксигемоглобина (полученного путем насыщения раствора оксигемоглобина оксидом углерода СО) или цианметгемоглобина (полученного из оксигемоглобина путем его обработки феррицианидом, а зате.ч цианидом) [1141]. Все сравниваемые образцы следует наносить в какой-либо одной форме. [c.321]

Зоны, представляющие интерес, вырезают и белок выделяют экстракцией [49, 64] или элюированием в условиях электрофореза [2, 175]. При определении аминокислотного состава приготовленных таким способом образцов обязательно вводят необходимые поправки, учитывающие присутствие акриламид-ного геля [26]. Согласно другому варианту, белки разделяют электрофорезом в блоке акриламидного геля, при этом под действием электрического поля белковые фракции попадают в проточную камеру, откуда и вымываются раздельно потоком элюэнта. Ход элюирования регистрируют с помощью проточного денситометра, элюат собирают на фракционном коллекторе. Недавно разработана методика элюирования белков из системы ПААГ —ДСН в промежуточный гель с использованием восходящего электрофореза [121]. Выход достигается высокий, однако образец может содержать примеси компонентов акриламидного геля и буферной системы. Гели для препаративного электрофореза могут иметь форму столбиков (LKB) или пластин (блоков) (Biorad). Для разделений по описанной методике 1 сп()льзуют различную аппаратуру, выпускаемую фирмами. [c.39]

Качество электрофореза проверяют с помощью хемископа ), а затем гель фотографируют камерой Поляроид , снабженной красно-оранжевым фильтром. На рис. 5.1 показаны полностью рестрицированные и разделенные путем электрофореза образцы ДНК из разных источников. Полосы калибровочных фрагментов ДНК (ДНК фага 1, рестрици-рованная HitidWl) должны быть четкими и хорошо разделившимися (дорожка 1), чтобы при необходимости можно было бы построить калибровочную кривую. Если полосы разделяются плохо, разрешение можно повысить либо увеличив время, либо подобрав соответствующую концентрацию агарозы ") ). Препараты плазмидной ДНК, обработанной рестриктазой (дорожка 2), должны достаточно хорошо разделиться, чтобы дальнейшую работу, например приготовление проб (разд. 5.6) либо выделение определенных фрагментов (разд. 1.5), можно было бы проводить без затруднений и иметь незагрязненные препараты. При электрофорезе рестрицированной тотальной ДНК агробактерий обычно видно множество полос различной интенсивности (дорожка 3), тогда как при рестрикции геномной ДНК растительного или животного происхождения (дорожка 4) [c.283]

С приготовленного разделяющего (нижнего) геля отсасывают всю жидкость н на глубину 1,5 см вставляют гребешок , формирующий карманы для образцов (таким образом, между этими карманами и верхним краем разделяющего геля остается расстояние по крайней мере в 1,5 см). Смесь концентрирующего геля дегазируют и после добавления ТЕМЭД (0,001 объема) наносят пипеткой на дно выемкн в стеклянной пластинке, после чего заливают его сверху бутанолом, насыщенным водой, и оставляют иа 30—60 мнн для полимеризации прн комнатной температуре. Удаляют гребешок и промывают концентрирующий гель верхним буфером с ДСН. После этого камера готова для нанесения образца и электрофореза (см. разд. И1). [c.75]

Рокет- иммуноэлектрофорез проводят в агарозе по Лореллу (Остерман, 1983). Иммуноэлектрофорез проводят на стеклянных пластинках размером 4.5 х 12 см. На пластинки наслаивают слой расплава 1%о-ного раствора агарозы, приготовленного на 0.025 М ацетат-барбиталовом буфере с pH 8.9, термостатированного при 45 С и смешанного с антителами. На крае стекла, обращенном к катоду, пробойником просекают цилиндрические лунки для образцов. Стекло со слоем геля на нем помещают на горизонтально расположенный столик прибора для электрофореза в агарозе и припаивают расплавом 1%>-ного раствора агарозы к агарозным столбикам, находящимся в катодном и анодном отсеках прибора для электрофореза. В качестве электродного также используют [c.81]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология