Гемоглобин электрофорез

Тонкие различия в первичной структуре родственных белков часто удается выявить методом отпечатков пальцев . Метод этот состоит в том, что белок подвергают частичному перевариванию с помощью одного или нескольких протеолитических ферментов, а затем разделяют продукты гидролиза и идентифицируют их, пользуясь для этого либо электрофорезом, либо хроматографией на бумаге. На фиг. 32 приведены полученные таким способом отпечатки пальцев , или пептидные карты , нормального и аномального гемоглобинов. Детальное изучение этих пептидных карт показывает, что все пептидные пятна, за исключением одного, идентичны. Таким способом генетически измененный структурный элемент выявляется очень легко, и для установления природы структурного изменения нет надобности устанавливать полную аминокислотную последовательность всей молекулы. Действительно, в ряде случаев весьма определенные указания относительно природы имеющегося замещения можно получить просто исходя из результатов анализа аминокислотного состава соответствующих пептидов, выделенных из двух белков. Но, конечно, однозначные доказательства замены одной аминокислоты на другую получают только после установления аминокислотной последовательности анализируемых пептидов. [c.96]

При наличии аномальных гемоглобинов электрофорез на ацетате целлюлозы желательно дополнять Другими высокоразрешающими электрофоретическими мето- [c.247]

После того как установлена первичная структура- какого-либо белка, обычно нет необходимости проводить полное изучение аминокислотной последовательности у гомологичных белков из близких (соответствующих) источников. Быстрый ответ можно получить, используя технику трипсинового фингерпринта . Для этого подвергают гидролизу трипсином белок с известной структурой и параллельно ему гомологичный белок полученные в результате гидролиза пептиды разделяют обычно с помощью двумерного электрофореза или хроматографии. Если разница в последовательностях невелика, то больщинство пептидов должны занимать идентичное положение на двумерном фингерпринте. Те немногие пептиды, которые отличаются по подвижности, необходимо элюи-.ровать и подвергнуть аминокислотному анализу по Эдману. Эта техника особенно полезна при изучении аномальных гемоглобинов, которые отличаются от нормального природой только одного участка. [c.276]

Ген, нередко встречающийся у лиц африканского происхождения, вызывает (в случае гомозиготности) тяжелое, часто летальное заболевание, получившее название серповидноклеточная анемия . В 1949 г. Полинг и Итано с сотрудниками обнаружили, что гемоглобин больных серповидноклеточной анемией имеет необычно высокую электрофоретическую подвижностьб. Позднее, в 1957 г., Ингрем разработал метод пептидных карт (гл. 2, разд. 3.2, рис. 4-20) и применил его для исследования гемоглобина. Он расщепил молекулу гемоглобина трипсином на 15 пептидов и разделил полученную смесь с помощью электрофореза и хроматографии. Ему удалось показать, что аномалия, характерная для серповидноклеточного гемоглобина (гемоглобина 5), локализована в Р-цепи (в шестом положении) (рис. 4-17). Глутаминовая кислота, находящаяся в этом положении в нормальном гемоглобине, оказалась замещенной в гемоглобине 5 на валин. Это [c.314]

Рис. 6-8. Пептидная карта, полученная после расщепления нормального гемоглобина человека трипсином. Каждое пятно содержит один из пептидов. Чтобы получить такую двумерную карту, смесь пептидов наносят на лист бумаги квадратной формы, проводят электрофорез в одном направлении, параллельном одной из сторон квадрата, после чего бумагу высушивают, а затем проводят хроматографическое разделение пептидов в другом направлении, перпендикулярном первому. Ни один из этих двух процессов в отдельности не позволяет разделить пептиды полностью, однако последовательное их осуществление оказывается очень эффективным способом разделения сложных пептидных смесей.

Работа 21. Разделение полипептидных цепей гемоглобина с помощью электрофореза в полиакриламидном геле [c.39]

При каком значении pH будет достигнуто наиболее эффективное разделение методом электрофореза следующих белковых смесей а) многлобин и химотрипсиноген б) яичный альбумин и пепсин в) сывороточный альбумин и гемоглобин (р/ белков приведены в таблице) [c.36]

Аномальные гемоглобины, различающиеся по форме, химическому составу и величине заряда, были вьщелены при помощи электрофореза и хроматографии. Передающиеся по наследству изменения чаще всего являются результатом мутации единственного триплета, приводящей к замене одной какой-либо аминокислоты в полипептидных цепях молекулы гемоглобина на другую. В большинстве случаев происходит замена кислой аминокислоты на основную 1ши нейтральную (табл. 2.1). Поскольку это замещение осуществляется в обеих полипептидных цепях одной из пар (а 1ШИ 3), образовавшийся аномальный гемоглобин будет отличаться от нормального величиной заряда и соответственно электрофоретической подвижностью. [c.82]

Цитохромоксидазы выполняют в аэробных организмах уникальную функцию они соединяются с Ог почти таким же образом, как и гемоглобин, а затем быстро восстанавливают Ог до двух молекул НгО [24а]. Происходит разрыв связи О—О для восстановления требуется четыре электрона. Очевидно, процесс этот сложен и пока еще плохо изучен. Важно отметить, что цитохромоксидаза, содержащаяся в митохондриях млекопитающих, имеет два гема (цитохром а) и два атома u(I) на одну функциональную единицу. Таким образом, при восстановлении обеих молекул цитохрома а и двух атомов меди может быть запасено четыре электрона для последующего восстановления одной молекулы Ог. Химия цитохромоксидазы слабо изучена. Как впервые обнаружил Кейлин, только половина молекул цитохрома а соединяется с СО. Она была названа цитохромом аз. По данным электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия, в цитохромоксида-зе дрожжей имеется шесть или семь субъединиц с мол. весом от 5 000 до 42 000 [24Ь, с]. Интересно отметить, что три наиболее крупные субъединицы, по-видимому, кодируются генами митохондриальной ДНК. Группы гема присоединены к пептидам меньшего размера. Было высказано предположение, что в интактном ферменте молекула Ог вначале связывается между атомом железа цитохрома аз и ионом двухвалентной меди aV—Ог—Си+. На следующей стадии происходит двухэлектронный процесс восстановления Ог с образованием перекисной структуры и далее двух молекул воды. [c.376]

Здесь для сравнения приведены две другие аномальные формы гемоглобина, С и О.) Можно видеть, что гемоглобин 5 отличается от гемоглобина А лишь тем, что в одной из цепей один из остатков глутаминовой кислоты замещен в нем на валин. Благодаря этому замещению возникает различие в один заряд на одну половину молекулы. Почему это различие приводит к столь большому различию растворимостей, наблюдаемому в эксперименте, пока не ясно. В гемоглобине С тот же остаток глутаминовой кислоты замещен положительно заряженным остатком лизина. Таким образом, в трипсиновом гидролизате НЬС имеется пептид, обладающий противоположным зарядом по сравнению с соответствующим пептидом в гидролизате НЬА. Гены, определяющие гемоглобины А, 5 и С, аллельны между собой. Что касается гемоглобина О, то генетики установили, что он неаллелен с остальными тремя. Интересно, что в НЬО замещен аминокислотный остаток, соседний с тем, который замещается в гемоглобинах 5 и С. С помощью электрофореза, чувствительного в первую очередь к различиям в зарядах, был обнаружен также ряд других аномальных гемоглобинов. Детально описать ЭТИ различия можно будет лишь после того, как будет установлена последовательность аминокислот в каждом из исследуемых гемоглобинов. Замещение одной аминокислоты на другую может и не привести к изменению функции гемоглобина, т. е. иметь лишь генетическое, а не физиологическое значение. По-видимому, в случае НЬО дело обстоит именно так. [c.224]

В этой работе.используют два прибора. В первом проводят электрофорез гемоглобина в геле, не содержащем мочевины. Соответственно в трубочки вносят раствор гемоглобина в 0,1 моль/л ЫаС. Во втором приборе [c.39]

В ряде работ описано разделение ферментов [258, 307— 309] гемоглобина [257, 270, 310—314] и белков [270, 314—322] методом тонкослойного электрофореза на крахмальном геле. [c.165]

Известен также метод пептидных карт, позволяющий устанавливать незначительные различия в первичной структуре родственных Б. Для этого Б. частично гидролизуют специфич. протеолитич. ферментами (особенно удобен трипсин, разрывающий пептидные связи у карбонильных п)упп остатков лизина и аргинина), затем пептиды каждого Б pa дeляют электрофорезом и распределительной хроматографией При сравнении полученных пептидных карт различных Б оказывается, что все идентичные пептиды располагаются в определенных (одних и тех же) местах, за исключением пептидов, по к-рым Б отличаются друг от друга Этим методом впервые обнаружено, что при замене одного остатка глутаминовой к-ты в молекуле гемоглобина на остаток валина образуется серповидноклеточный гемоглобин, встречающийся при одном из видов анемии. Методом пептидных карт изучают генетич. аспекты эвотюционных изменений Б. и выявляют изменения Б. при различных заболеваниях. [c.121]

Другими методами, кроме электрофореза. Но в восстановленной форме НЬ5 в 50—100 раз менее растворим, чем НВА, что и заставляет клетки крови, содержащие такой гемоглобин, принимать характерную серповидную форму. Частота гена НЬ5 много выше нормальной частоты мутаций. Она особенно высока в малярийных местностях, так как наличие этого гена связано с устойчивостью к малярии. [c.223]

В крахмальном геле можно работать при pH от 2 до 11. Этим методом были изучены многие белковые смеси, прежде всего сыворотка крови и гемоглобины. Основные результаты этих работ можно найти в обзорах [43, 44]. Как уже говорилось, в сыворотке крови крахмальный гель позволяет обнаружить до 30 компонентов это количество столь велико, что до сих пор не установлено, какую сыворотку считать нормальной , так как у каждого животного и человека имеются индивидуальные, генетически детерминированные отличия. При сравнении с данными электрофореза на бумаге следует помнить, что порядок расположения компонентов в геле может быть совершенно иным. Кроме того, электрофореграмма в геле, вообще говоря, неаддитивна благодаря влиянию одних компонентов на подвижность других, так как присутствие белков в высокой концентрации в узких зонах приводит к локальным изменениям проводимости, pH и вязкости среды иногда наблюдается и прямое взаимодействие белков. Для сопоставления с результатами электрофореза сыворотки крови на бумаге применяют так называемый двухмерный электрофорез. В этом случае сыворотку сначала разделяют на бумаге. После этого зоны не фиксируют, а влажную бумагу прижимают к поверхности крахмального геля и проводят дополнительный электрофорез в геле в перпендикулярном направлении. Лишь после этого зоны проявляют. Этот метод позволяет еще более улучшить разделение. [c.97]

Принятые обозначения г—гамма-глобулин. 50 мкг гп—гл —комплекс гаптот глобин-гемоглобин, 50 мкг гф—трансферрин, 25 мкг гл —гемоглобин а—альбумин. 25 мкг 01 —антитрипсин, 25 мкг па—преальбумин, 25 мкг. Результаты, полученные одним лишь электрофорезом в геле, приведенц справа. [c.338]

Изоэлектрическую точку можно найти прямым путем методами потенциометрического титрования или электрофореза. В последнем случае изо-электрическая точка определяется как такое значение pH, при котором электрофоретическая подвижность и полиионов равна нулю. Для нахождения изоэлектрической точки измеряют подвижность нолиионов при различных 5,0 е,о 7,0 з,о рн значениях pH и затем путем интер- р с. у.8. Завнспмость электро-поляции находят значение pH, при форетической подвижности и котором и = 0. Пример такого на- гемоглобина от pH среды, хождения изоэлектрической точки (для [c.145]

Полинг и его сотрудники [17] обнаружили различия подвижности 5- и А-гемоглобинов при электрофорезе, что объясняется различием в аминокислотном составе и, тем самым, в числе заряженных групп. Полинг определил болезни гемоглобина как молекулярные. Действительно, Ингрэм [18] показал, что отличие аномальных гемоглобинов от нормального определяется замещением всего лишь одного остатка в белковой цепи, — ведь смысл текста существенно меняется при замене одной буквы . В табл. 2.4 указаны некоторые патогенные замещёния в гемоглобине человека [13, 19]. Сейчас известно около 100 мутантных гемоглобинов человека. [c.78]

Пример использования хроматографии на бумаге в сочетании с электрофорезом пептидов взят из работы Ингрэма [18], посвященной изучению строения гемоглобинов. Триптические гидролизаты гемоглобина А и гемоглобина 5 сравнивали путем электрофореза на бумаге ватман № 3 ММ в системе пиридин — уксусная кислота — вода, pH 6,5, 19 в/см, в течение 150 мин, с последующей хроматографией в системе н-бутанол — уксусная кислота — вода (3 1 1) в течение 24 час. Полученные картины (фиг. 25) почти идентичны, [c.54]

Строение гемоглобинов. Существует несколько гемоглобинов кроме гемоглобина А нормального взрослого человека и гемоглобина Р зародыша, различают ряд аномальных или патологических ге моглобинов (С, Е, О, Н, I, 8 и т.д.) на основании их поведения при электрофорезе, хроматографии и по отношению к ферментам. [c.433]

В дополнение к основному гемоглобину HbAj в крови взрослого человека доказано существование мигрирующего с меньшей скоростью при электрофорезе гемоглобина НЪЛ также состоящего из 4 субъединиц двух а-цепей и двух б-цепей. На долю НЬА, приходится около 2,5% от всего гемоглобина. Известен, кроме того, фетальный гемоглобин (гемоглобин новорожденных), обозначаемый HbF и состоящий из двух а-цепей и двух Y-цепей. Фетальный гемоглобин отличается от HbAj не только составом аминокислот, но и физико-химическими свойствами спектральным показателем, электрофоретической подвижностью, устойчивостью к щелочной денатурации и др. Кровь новорожденного содержит до 80% HbF, но к концу 1-го года жизни он почти целиком заменяется на НЬА (все же в крови взрослого человека открывается до 1,5% HbF от общего количества гемоглобина). Последовательность аминокислот в у- и б-цепях гемоглобинов окончательно не расшифрована. [c.81]

Гаптоглобин входит в состав глобулиновой фракции. Этот белок обладает способностью соединяться с гемоглобином. Образовавшийся гаптоглобин— гемоглобиновый комплекс может поглощаться системой макрофагов, ири этом предупреждается потеря железа, входящего в состав гемоглобина как ири физиологическом, так и ири патологическом его освобождении из эритроцитов. Методом электрофореза выявлены 3 груииы гаитоглобинов Нр 1—1, Нр 2—1 и Нр 2—2. Установлено, что имеется связь между наследованием типов гаитоглобинов и резус-антителами. [c.577]

О появлении множества ложных зон при электрофокусировании гемоглобина в геле с персульфатом калия сообщает Ригли [4]. В этом случае появления артефактов не удается избежать даже предварительным электрофорезом в течение 80 мин. Этот факт говорит о том, что при наличии в геле персульфата предварительный электролиз, возможно, является недостаточной мерой. Поэтому рекомендуется всякий раз, когда это возможно, получать гель фотополимеризацией. [c.328]

Почему при электрофорезе в полиакриламидном геле раствора гемоглобина в 8 моль/л растворе мочевины на фореграмме получаются две белковые полосы [c.43]

Пероксидаза хрена в действительности не является простым ферментом. По-видимому, у многих, если не у всех, высших растений имеется множество форм пероксидазы (иногда их называют изоферментами) которые удается разделить методами электрофореза и (или) хроматографии. Множественность форм пероксидазы можно сопоставить с неоднородностью, обнаруженной у гемоглобинов (разд. 7.1 и 7.2). В корнеплоде репы найдено, например, семь изоферментов [151 ], а в хрене — около десяти изоферментов [131 ]. Относительная концентрация изоферментов может варьировать в зависимости от времени года [151 или от одной части растения к другой [147]. Подобные колебания в относительной концентрации изоферментов, возможно, связаны с различными и изменяющимися функциями пероксидаз в метаболизме растений. Четыре изофермента пероксидазы хрена, которые удалось выделить в очищенном состоянии, как оказалось, все содержат углеводный фрагмент и имеют примерно одинаковый аминокислотный состав [131]. Природа неоднородности остается неясной. Спектры различных изоферментов пероксидазы хрена почти идентичны, и практически совпадает их ферментативная активность, что облегчает сопоставле- [c.197]

В конце 40-х годов Лайнус Полинг и Гарвей Итано обнаружили, что серповидноклеточный и нормальный гемоглобины, помещенные в электрическом поле, т.е. подвергнутые электрофорезу (разд. 6.6), мигрируют к положительно заряженному электроду с разными скоростями гемоглобин 8 немного отстает от гемо- [c.216]

Электрофоретические свойства очень чувствительны к изменениям размеров, формы, числа заряженных групп макромолекулы, которые часто нельзя обнаружить другими методами. Изменения, вызванные старением при хранении растворов, различными химическими воздействиями, небольшие видовые различия и т. д., могут быть легко замечены при фронтальном электрофорезе. Примером является найденное Полингом с сотрудниками различие в полон ении изоэлектрической точки нормального гемоглобина человека и гемоглобина больных серповидно-клеточной анемией (Ар1=0,22). Как показал позднее Ингрэм, это различие вызвано заменой всего одной кислой аминокислоты в белковой макромолекуле на нейтральную (глутаминовой кислоты на валин). [c.63]

Коллоидные растворы устойчивы, не разрушаются долгое время (месяцы и годы). Дисперсная фаза их, состоящая из малорастворимых веществ, не выпадает в осадок, хотя, сталкиваясь, коллоидные частицы должны были бы слипаться, укрупняться, оседать под действием силы тяжести. Причины этого выяснил профессор Московского университета Ф. Ф. Рейсс (1809), открывший явление электрофореза, т. е. передвижения коллоидных частиц к одному из электродов при пропускании тока через раствор. Было установлено, что коллоидные частицы гидроокисей металлов, гемоглобина, некоторых красок заряжены положительно и передвигаются к катоду. Коллоидные частицы металлов и сульфидов металлов, перемещающиеся к аноду, заряжены отрицательно. Таким образом, оказалось, что все коллоидные частицы в том или ином растворе заряжены одноименно. Поэтодгу в растворах происходит их взаимное отталкивание, препятствующее укрупнению частиц и обус.ловливающее устойчивость коллоидных систем. [c.234]

Гемоглобины дают очень интересный материал для изучения генетических мутаций у высших животных и человека. Их разделение и идентификация осуществляются обычно на бумаге или ацетат-целлюлозной мембране при pH 6,5 в фосфатном или како-дилатном буфере, хотя отличия в электрофоретической подвижности между некоторыми из них очень невелики. Электрофорез в гелях, обладающий гораздо большей разрешающей силой, все чаще применяется для вышеуказанной цели [53]. [c.103]

Агаровые слои применялись при электрофорезе белков [254, 255, 276—286], мукополисахаридов [287], фосфорорганических пестицидов [288], гемоглобина [289—291], компонентов нуклеи- [c.164]

Электрофорез на крахмальном геле использовали также для разделения и идентификации гемоглобинов [195—197]. Раймонд и сотр. [198—200] считают целесообразным проводить электрофорез на геле акриламида. Как и на крахмальном геле, при этом на акрпламиде можно добиться лучшего разделения, чем на агаровом студне. Эти авторы исследовали разделение проб сыворотки на 3—25 %-ных гелях. Эти же авторы описали методику двумерного электрофореза. Согласно этой методике, электрофорез проводят в одном направлении при данной концентрации геля, затем полосу геля, содержащую разделенные белки, внедряют в слой геля другой концентрации и повторяют электрофорез в другом направлении. Эспиноза [201] использовал такой же принцип и проводил в одном направлении разделение на агаровом геле, а в другом — на крахмальном геле. [c.517]

Гемоглобин — сопряженные белки, содержащие глобины и гем (пигмент), состоящий из протопорфирина и двухвалентного железа), анализировали на слоях оксида алюминия и диэтиламиноэтилцеллюлозы, а также посредством электрофореза на геле крахмала [151—153]. Довольно широко применялся для разделения гемоглобинов тонкослойный электрофорез на агаре 154—157] и на крахмале [151, 158—163]. Шредер и Нельсон 164] применяли для хроматографии гемоглобинов ионообменные слои карбоксиметилцеллюлозы СМ-52 (Whatman). [c.280]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология