Центрифугирование в градиенте плотност

Осторожным наслаиванием растворов сахарозы с последовательно уменьшающейся плотностью или центрифугированием растворов, содержащих кроме исследуемых веществ равномерно распределенные по объему пробирки соли цезия или рубидия, можно создать градиент плотности растворителя по высоте пробирки. Центрифугирование в ячейках с градиентом плотности приводит к накоплению вещества в очень узкой области, в которой плотность вещества совпадает с плотностью растворителя. Центрифугирование в градиенте плотности применяется, в частности, при изучении нуклеотидов. [c.157]

Фракционирование белков, нуклеиновых кислот и других макромолекул при центрифугировании в градиенте плотности сахарозы основано на различии в скорости седиментации молекул, пропорциональной их молекулярной массе. Фракции РНК, обладающие различной молекулярной массой, после центрифугирования распределяются в линейном градиенте концентрации сахарозы при этом благодаря значительной вязкости растворов сахарозы улучшается разделение и уменьшается возможность смешивания различных фракций. [c.172]

Для грубого предварительного разделения клеточных фрагментов достаточно кратковременного последовательного центрифугирования при нескольких разных скоростях (с разным центробежным ускорением) (разд. 3.1. а). Однако, чтобы получить максимально чистые препараты органелл или молекул, используют центрифугирование в градиенте плотности. Например, для разделения РНК на несколько фракций, различающихся по константам седиментации, сначала в пластмассовой центрифужной пробирке создают градиент концентраций раствора сахарозы (от 25% на дне до 5% на поверхности). Затем сверху аккуратно наслаивают препарат РНК и проводят центрифугирование с очень высокой скоростью в течение нескольких часов. Препарат РНК разделяется на ряд медленно седиментирующих резких полос, стабилизируемых градиентом сахарозы. Затем пробирку прокалывают снизу и собирают фракции по каплям в пробирки с помощью коллектора фракций. Далее определяют положеиие каждой фракции и содержание в ней РНК. [c.163]

Следует также упомянуть метод центрифугирования в градиенте плотности. Обычно работают в возрастающем градиенте плотности сахарозы при высокой скорости ротора. Расстояние, на которое перемещается белок в градиенте, обратно пропорционально его молекулярной массе. Молекулярную массу неизвестного белка с достаточной точностью можно определить, сравнивая его с добавленным стандартным белком известной молекулярной массы. [c.361]

Рис. 51. Картина стационарного распределения концентрации (а) и градиента концентрации (б) в кювете ультрацентрифуги при центрифугировании в градиенте плотности.

В настоящее время метод центрифугирования в градиенте плотности получил широкое распространение. [c.172]

Весьма перспективным для количественной характеристики композиционной неоднородности представляется центрифугирование в градиенте плотности [143 144, с. 418]. Метод позволяет, в принципе, найти функцию композиционного распределения. Но однозначная интерпретация данных центрифугирования в градиенте плотности требует преодоления больших экспериментальных трудностей [145, 146], поэтому этот метод применяют редко [142, 147, 148]. [c.152]

При сопоставлении экспериментально найденных параметров композиционной неоднородности с величинами, рассчитанными на основе теории сополимеризации, обнаруживаются значительные расхождения. Так, для сополимера стирола с метилметакрилатом с теоретическим значением дисперсии композиционного распределения л 10 центрифугирование в градиенте плотности дает величину дисперсии 10 а светорассеяние — в зависимости от методики измерений — от 10"3 до 10 [142]. [c.152]

Выделение субклеточных частиц Дифференциальное центрифугирование, центрифугирование в градиенте плотности, зональное центрифугирование 9, 10 [c.66]

Центрифугирование в градиенте плотности. . . 3 99 Применение седиментационного анализа [c.197]

Центрифугирование в градиенте плотности используют для разделения компопептов смеси нолимеров па дискретные зоны (т. наз. зонное центрифугирование). В аналитич. УЦ возможно обнаружение микрогеля, оценка его мол. массы, определение различия в плотностях компонентов в р-ре, получение распределения гю мол. массам и химич. составу, оценка средних мол. масс (включая М ), изучение избирательной сорбции одного из растворителей полимером. Метод не чувствителен к наличию примесей, даже если они высокомолекулярны или присутствуют в больших количествах. [c.200]

Седиментационный анализ включает следующие три основных экспериментальных метода скоростную С., изучение седиментационного равновесия и процесса приближения к равновесию. Скоростная С. позволяет определить константу С. полимера и полидисперсность образца изучение седиментационного равновесия — мол. массу различных типов усреднения изучение приближения к равновесию — мол. массу (менее надежно, но и с меньшей затратой времени, чем в предыдущем методе) и неоднородность состава полимера. Процесс С., состояние равновесия и приближение к нему м. б. исследованы также в условиях искусственно создаваемого в кювете градиента плотности центрифугирование в градиенте плотности — важный метод определения мол. массы, наличия неоднородности и ее типа служит также для разделения. [c.198]

Если можно получить радиоактивно меченые молекулы белков, как, например, в случае бактерий, то для изучения четвертичной структуры можно использовать метод гибридизации. При денатурации, приводящей к обратимой диссоциации белковых молекул на субъединицы, можно получить гибриды тяжелых и легких молекул и разделить затем эти гибриды центрифугированием в градиенте плотности. Число субъединиц, появляющихся при денатурации, можно установить непосредственно по различиям плотностей гибридных тяжелых и легких молекул. [c.402]

Б. Разделение тех же РНК путем центрифугирования в градиенте плотности сахарозы и сбора проб в пробирки, как указано в подписи к фпг. 8. [c.41]

Фракция ДНК, содержащая высокоповторяющиеся геномные последовательности, включает, по-видимому, функционально и в значительной степени структурно обособленную часть генома, представленную сатяллитными ДНК. Сателлитные ДНК обладают характерным нуклеотидным составом и, следовательно, плотностью, отличающейся от валового нуклеотидного состава тотальной ДНК-Поэтому их удается в ряде случаев отделить от основной массы ДНК центрифугированием в градиенте плотности СзО (рис. 108, а). Отдельные фракции сателлитных ДНК могут составлять до 10 % от общего содержания ДНК, как, например, один из сателлитов-генома мыши. В составе одного генома можно обнаружить несколько разных сателлитных ДНК- [c.188]

В основе одного из первых механизмов, предложенных для объяснения генетической рекомбинации, лежало предположение, что рекомбинация непосредственно связана с синтезом ДНК. Согласно этому механизму выбора копии , репликация протекает вдоль одной из цепей ДНК до какой-то случайной точки, в которой полимераза перескакивает на вторую из двух гомологичных хромосом и начинает копировать ее. Согласно этому механизму, вновь образованная молекула ДНК будет частично комплементарна одной родительской двухцепочечной молекуле ДНК, а частично — другой. Чтобы проверить правильность этого предположения, Меселсон и Вейгле [220] заражали Е. oli двумя штаммами фага содержащими ДНК, меченную стабильными изотопами соответственно углерода ( С) и азота ( N). Центрифугирование в градиенте плотности показало, что рекомбинантная ДНК содержала как С, так и N. Таким образом, стало ясно, что в рекомбинант- ную ДНК потомства включается ДНК обоих родителей. Этот результат не подтвердил гипотезы выбора копии и свидетельствовал в пользу механизма, предполагающего, что рекомбинация сопровождается расщеплением цепей. [c.282]

Пря улыпрацентрифугировании для разделения используется седиментация, зависящая от размера, плотности и формы молекулы белка. Центрифугирование в градиенте плотности (зональное центрифугирование) часто применяется для разделения белков, а также для разделения органелл и вирусов. Одной из характеристик белка служат данные седиментационного анализа в ультрацентрифуге (разд. 3.5.4). Положение возникающих белковых зон можно наблюдать с помощью оптических методов. [c.349]

Особенно интересна возможность установить характер распределения нуклеотидов по цепи путем исследования перехода спираль — клубок. Установлено, что ДНК ряда умеренных фагов содержит области, различаюш,иеся по концентрации пар Г — Ц [107]. Это отражается в появлении ступенек на кривой плавления и в распределении фрагментированных молекул ДНК при центрифугировании в градиенте плотности. Такую блочную гетерогенность можно исследовать путем параллельного изучения кривых плавления и зависимости характери( тичеСкой вязкости от Г в области перехода [107]. [c.515]

Для идентификации гена, кодирующего протоксин, используют обычную методику. В. thuringiensis выращивают в культуре и лизируют клетки. Выделяют суммарную клеточную ДНК и центрифугируют ее в градиенте плотности s l, чтобы разделить плазмидную и хромосомную ДНК. Если гены протоксинов входят в состав генома, создают банк клонов хромосомной ДНК. Если же они содержатся в плазмиде, то плазмидную ДНК фракционируют по размерам центрифугированием в градиенте плотности сахарозы. Это обогащает ту плазмидную фракцию, которая послужит в дальнейшем исходным материалом для идентификации генов протоксинов (рис. 15.3). [c.335]

Обычно миелин получают гемогенизацией нервной ткани с последующим фракционированием посредством центрифугирования в градиенте плотности. Его плотность составляет 1,08 г/мл, что позволяет применять изопикнические методы. Данные анализа, полученные различными исследователями, отличаются причиной могут быть примеси аксональной мембраны. [c.99]

В то время как электрофизиологи работают с интактным синапсом, биохимики пытаются выделить его функциональные субструктуры посредством контролируемого разрушения и последующего фракционирования методом центрифугирования в градиенте плотности. Примерами таких суб- , , и -I. I структур являются синаптосо- с ]с сщ — оторванные от аксонов и [c.190]

ДНК Колориметрический анализ (реакция с дифениламином) Центрифугирование в градиенте плотности (се-диментацнонное поведение) 2 [c.574]

Для этой цели в 1ТЬследнее время стали применять метод центрифугирования в градиенте плотности, дающии сведения о распределении полимеров не только по молек улярной массе, но и по химическому составу (см. ниже). [c.541]

Важной разновидностью седимеита-ционного метода, получившей широкое применение при исследовании природных полимеров, является центрифугирование в градиенте плотности [3, с. 418]. В центрифужной пробирке создают градиент плотности (например, смёшивая при помоши автоматически действующих насосов водный раствор сахарозы с водой в постепенно уменьшающихся соотношениях), а затем наслаивают поверх него исследуемый раствор полимера в легком растворителе (рис. 169). [c.544]

Метод центрифугирования в градиенте плотности был изобретен впервые Линдерштрём-Лангом. К изучению нуклеиновых кислот в водных растворах его с успехом применили Месельсоп, Сталь и Виноград [26]. Для линейных полимеров в органических растворителях его впервые разработали Бреслер, Нырков и [c.171]

Рис. 27-15, Принцип гибридизационного теста. Два препарата ДНК, выделенной из организмов разных идов, нагревают так, что они полностью денатурируют и их цепи расходятся. При смешивании этих препаратов и медленном охлаждении комплементарные цепи ДНК каждого вида на йдут друг друга и будут ренатурировать с образованием нормальных дуплексов. Если между двумя ДНК существует значительная гомология по последовательности, то возможно образование гибридных молекул, представляющих собой частичные дуплексы. Чем выше степень гомологии, тем больше вероятность образования гибридов. Содержание гибридов в смеси можно измерить разными способами, в частности с помошью хроматографии или центрифугирования в градиенте плотности. Обычно, чтобы упростить процедуру измерения, одну из ДНК метят радиоактивным изотопом.

Если, например, вырастить культуру одной из бактерий на тяжелой воде (D2O), то у нее будет тяжелая ДНК, и тогда образование гетеродуплекса можно будет выявить путем центрифугирования в градиенте плотности s l-так же, как в опыте Меселсона и Сталя было доказано образование N/ N-rH6pHfl-ной ДНК. Можно, однако, пометить ДНК одного из партнеров, выращивая его на среде с С или с Если теперь смешать длинные отрезки денатурированной ДНК (из непомеченной С бактерии А) с короткими отрезками денатурированной ДНК (из помеченной С бактерии В), медленно охладить смесь и провести ее через фильтр, задерживающий длинные цепи, но пропускающий короткие, то на фильтре останутся молекулы гетеродуплекса. Оставшаяся на фильтре радиоактивность будет тем выше, чем больше радиоактивных отрезков (В) связалось с А-депями, т.е. она будет зависеть от того, идентичны ли (либо очень сходны) последовательности оснований ДНК А и В или же они совсем различны. Таким образом, реассоциация ДНК/ДНК дает возможность определять степень гомологии последовательностей ДНК разного происхождения. Контрольный опыт проводят с молекулами ДНК из одних и тех же бактерий (одну пробу метят, другую не метят) и произвольно принимают степень реассоциации за 100. Степень реассоциации молекул ДНК из различных штаммов выражают затем в процентах от этой величины. Рутинные методы определения гомологии между ДНК различных штаммов бактерий многократно видоизменялись, но все они основаны на том же принципе образования гетеродуплексов во всех случаях необходимо пометить одного из партнеров. [c.41]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология