Справочник химика 21

Химия и химическая технология

Статьи Рисунки Таблицы О сайте English

Аминокислотные секвенаторы

    Циклический характер этих реакпий дает возможность автоматизировать весь пропесс. В настояшее время выпускаются приборы (аминокислотные секвенаторы), производящие автоматическое определение последовательности аминокислот в пептидных фрагментах. На последнем этапе анализа последовательности аминокислот, полученные для пептидных фрагментов, располагают в том же порядке, как они были расположены в интактной цепи. Для этого сравнивают последовательности наборов перекрывающихся фрагментов, полученных при расщеплении одного и того же белка различными протеолитическими ферментами. [c.220]


    В период между 1925 — 1930 гг. Сведберг с помощью ультрацентрифугирования произвел определение молекулярных масс различных белков. Одновременно применение других аналитических методов, как, например, электрофореза и различных видов хроматографии, привело к развитию аналитической белковой химии. В 1951 — 1956 гг. Сенгер [20, 21] установил аминокислотную последовательность инсулина. Использованные при этом методы легли в основу систематического определения первичной структуры многих белков. Созданный Эдманом в 1966 г. секвенатор и применение масс-спектрометрии в сочетании с ЭВМ как средством регистрации, обработки и оценки масс-спектрометрических данных привели к тому, что к настоящему времени опубликовано более 15 ООО работ, посвященных определению аминокислотных последовательностей, и установлены первичные структуры более чем для 1000 белков. [c.343]

    Другой вариант автоматического определения аминокислотной последовательности коротких пептидов, основанный на ковалентном присоединении их к нерастворимому носителю, предложен Р. Ларсеном. Реакционным сосудом в твердофазном секвенаторе служит хроматографическая колонка, с носителем которой ковалентно связан исследуемый пептид. Через колонку последовательно пропускаются необходимые реагенты и растворители. Присоединение пептида к носителю является определяющей стадией в процессе. Для этой цели широко применяются матрицы на основе [c.63]

    Твердофазный секвенатор позволяет получать наилучшие результаты при анализе пептидов, содержащих от 5 до 40 аминокислотных остатков. Иногда он применяется и для изучения структуры более крупных пептидов и белков, особенно гидрофобных, легко вымываемых из реакторов жидкофазного прибора. С помощью этого метода удается определять последовательность 20 — 25 аминокислотных остатков. [c.66]

    После появления секвенатора время анализа аминокислотной последовательности белка стало определяться стадией очистки [c.128]

    Перечисленные методы определения аминокислотных последовательностей в пептидах и белках громоздки и, как правило, связаны с большим расходом вещества. В связи с этим в последние годы усилия многих ученых направлены на поиски новых подходов к решению этой проблемы. Существенным вкладом явилось появление секвенатора Эдмана (см. стр. 75). Кроме того, плодотворно развивается масс-спектрометрический метод изучения последовательности аминокислот в пептидах и низкомолекулярных белках. Возможность применения этого метода была подтверждена на примере синтетических олигопептидов Было установлено, что [c.85]


    По сравнению с секвенаторами других типов ГФ-прибор позволяет проводить определение аминокислотной последовательности белков (пептидов) на меньшем количестве материала [4]. [c.474]

    N-концевая аминокислотная последовательность белка или крупных пептидов определяется с помощью автоматических секвенаторов  [c.521]

    Заключительный этап работы при выяснении порядка следования аминокислотных остатков в белковой молекуле—воссоздание первичной структуры белка на основании данных о последовательности их расположения в пептидах, полученных при селективном гидролизе. Так как избирательное расщепление пептидных связей при исследовании первичной структуры белков ведут не менее чем двумя агентами, обеспечивающими разрыв пептидных связей в разных точках полипептидной цепи, то первичные структуры того и другого набора полученных пептидов неизбежно перекрываются. Это открывает возможность воссоздания первичной структуры белка (рис. 28). Если при посредстве секвенатора удалось выяснить чередование аминокислотных звеньев в фрагментах белковой молекулы значительного размера, то это существенно упрощает процесс воссоздания ее первичной структуры. [c.59]

    А (Б. Меррифилд, 1969). Дальнейшее развитие получили аналит. методы стал широко использоваться автоматич. аминокислотный анализатор, созданный С. Муром и У. Стайном в 1958, существенно модифицированы хроматографич. методы, до высокой степени совершенства доведен рентгеноструктурный анализ, сконструирован автоматич. прибор для определения последовательности аминокислотных остатков в Б.-секвенатор (П. Эдман, Г. Бэгг, 1967) Благодаря созданию прочной методнч. базы стало возможным проводить широкие исследования аминокислотной последовательности Б. В эти годы была определена структура неск. сотен сравнительно небольших Б. (до 300 аминокислотных остатков в одной цепиХ полученных из самых разл. источников как животного, так и растит., бактериального, вирусного и др. происхождения. Среди них — протеолитич. ферменты (трипсин, химотрипсин, субтилн-зин, карбоксипептидазы), миоглобины, гемоглобины, цитохромы, лизоцимы, иммуноглобулины, гистоны, нейротоксины, Б. оболочек вирусов, белково-пептидные гормоны и др. В результате были созданы предпосылки для решения актуальных проблем энзимологии, иммунологии, эндокринологии и др. областей физ.-хим. биологии. [c.248]

    Для непосредственного анализа первичной структуры Б. обычно используют сек вен а тор-прибор, к-рый с высокой эффективностью осуществляет последовательное авто-матнч. отщепление N-концевых аминокислотных остатков путем деградации Б. по методу Эдмана. Все р-ции проводятся в цилиндрич. стеклянном стаканчике, вращающемся с постоянной скоростью в атмосфере инертного газа (рис. 4). Образец Б. распределяется на стенках стаканчика в виде тонкой пленки. Оптимизация процесса и тщательная очистка используемых реагентов и растворителей позволили поднять общий выход реакцин до 95% и выше. Наилучшие объекты для секвенатора-Б. и пептиды, содержащие в своем составе от 60 до 200 аминокислотных остатков для таких соединений обычно удается определять последовательность 30-35 (в ряде случаев 40-50) [c.252]

    К середине 1940-х годов пептидная теория белков Фишера и Вальд-шмидт-Лейтца была почти повсеместно принята. Встал вопрос о точном знании деталей химического строения, т.е. о конкретном порядке расположения аминокислот в белковых цепях. Впервые такое сложное исследование удалось провести в течение десятилетия (1945-1954 гг.) ф. Сенгеру, определившему аминокислотную последовательность инсулина. Вторым белком была рибонуклеаза А. Полная структура этого фермента расшифрована С. Муром, К. Хирсом и У. Стейном (1960 г.). Вскоре идентификация химичекого строения белков стала производиться с помощью автоматических секвенаторов и приобрела рутинный характер. Однако достижения в решении первой фундаментальной задачи проблемы белка не принесли удовлетворения. Сначала не вызывало сомнений, что химические и физические свойства белков получат свое объяснение, как только станет известно химическое строение их молекул. Однако основанная на опыте всей органической химии и биохимии надежда на то, что установление химического типа и строения молекул окажется достаточным для понимания хотя бы в общих чертах их специфического функционирования, не оправдалась. Тем самым определение структуры из конечной цели исследования превратилось в необходимый для последующего изучения белков начальный этап. Утвердилась мысль, что химическая универсальность и практически необозримое многообразие свойств соединений этого класса при строгой специфичности его отдельных представителей связаны с особенностями пространственных структур белковых молекул. [c.67]

    Эту процедуру ступенчатого расщепления пептида с N-конца можно повторять многократно, идентифицируя последовательно одну аминокислоту за другой. Метод Эдмана используется в качестве химической основы для определения первичной структуры белков и пептидов. Он реализован в специальном приборе-секвенаторе (от англ. sequen e - последовательность), работающем в автоматическом режиме и позволяющем определить последовательность аминокислот с N-конца пептида до 50-60 аминокислотных остатков. [c.54]


    Превращение N-концевого аминокислотного остатка в тиогидантоин приводит к укорочению анализируемой полипептидной цепи на одно звено. Выделив этот пептид, исследователь получает возможность повторить всю процедуру, установить природу второго аминокислотного остатка и выделить полипептид, укороченный на два звена. Многократное повторение такой ступенчатой деградаций дает возможность последовательно идентифицировать все составляющие исходный полипептид остатки аминокислот, т.е. установить его первичную структуру. Практически в ручном варианте метод Эдмана позволяет сделать один-два десятка шагов. Работа сводится к многократному повторению одних и тех же чередую-пщхся процедур добавления изотиоцианата, отщепления тиогидантоина, отделения его от укороченного пептида для последующей идентификации, выделение оставшегося полипептида в виде, пригодном длЯ следующего шага обработки. Чтобы избавить исследователей от такой монотонной работы, требующей вместе с тем строгого соблюдения условий эксперимента на каждом шаге, созданы специальные автоматизированные установки для проведения всех перечисленных операций — автоматические секвенатори полипептидов. С их помсоцью удается провести до 40 — 60 шагов ступенчатой деградации. [c.271]

    Нанлучшнмн объектами для жндкофазного секвенатора являются белки и пептиды, содержв1цне в своем составе от 60 до 200 аминокислотных оствтков. Для них обычно удается определять последовательность 30 — 50 остатков. При исследовании более крупных белков в процессе деградации наблюдается значительный гидролиз [c.62]

    Стратегические принципы изучения первичной структуры белка претерпевали значительные изменения по мере развития и усовершенствования применяемых методов. Следует отметить три основных этапа в их развитии. Первый этап начался с к лассической работы Ф. Сенгера (1953) по установлению аминокислотной последовательности инсулина, второй — с широкого введения в структурный анализ белка автоматического секвенатора (начало 70-х годов) и, наконец, третий — с разработки скоростных методов анализа нуклеотидной последовательности ДНК (А. Максам, В. Гилберт, Ф Сенгер, начало 80-х годов). [c.76]

    Уменьшение количеств белков и пептидов, необходимых для анализа их структуры, является одной из центральных проблем, стоящих перед исследователями. С целью ее решения ведется поиск новых методов изучения структуры, в частности более чувствительных способов идентификации производных аминокислот (см. с. 61). Один из перспективных подходов заключается в широком использовании радиоактивных методов анализа. В ряде лабораторий при деградации пептидов в секвенаторе применяется радиоактивный или С-ФИТ1Д. Можно вводить радиоактивную метку непосредственно в анализируемый белок. Для многих белков это достигается добавлением радиоактивно меченных аминокислот непосредственно в питательную среду, на которой выращивается культура, являющаяся источником исследуемого белка. Таким же путем оказывается возможным радиоактивно метить белок избирательно по определенным аминокислотным остаткам. Если белок, радиоактивно меченный, например, по остаткам лейцина, анализировать с помощью секвенатора, то простое измерение радиоактивности экстрактов, содержащих анилинотиазолиноны, позволяет безошибочно определить, в каких положениях полипептидной цепи в N-концевой области белка расположены остатки лейцина (рис. 31). Аналогичным образом можно определить положение и других аминокислотных остатков. Такой прием используется для анализа N-koh-цевой последовательности предшественников белков, доступных лишь в ничтожно малых количествах. Для исследования полной структуры он, однако, не применяется из-за дороговизны и трудоемкости. [c.79]

    В качестве критериев чистоты ферментов используют данные электрофореза, ультрацентрифугирования (седиментограмма), определения молекулярной массы различными методами, по растворимости (кривые растворения), оценки полидисперсности с определением специфической активности каждой фракции, хроматографирования на различных носителях и в нескольких системах, аминокислотного состава (особенно — при обнаружении белковых примесей), включая секвенирование (от англ sequen e — последовательность) на автоматизированных приборах - секвенаторах, ит д [c.56]

    Можно предвидеть значительное улучшение химических и биохимических методов определения последовательностей оснований в нуклеиновых кислотах и аминокислотных последовательностей в белках. Сейчас газофазный секвенатор, работающий в автоматическом режиме, позволяет надежно определять до 60 последовательно расположенных аминокислот (называемых аминокислотными остатками), расположенных с аминоконца белка. Применение тандемной масс-спектрометрии или других новых методов позволяет устанавливать в автоматическом режиме полные аминокислотные последовательности белков, содержащих несколько сот аминокислотных остатков. [c.180]

    После аминокислотного анализа пептидов часто проводят их концево анализ, что в случае ди- итрипептидов дает возможность сразу определить последовательность аминокислот. Для изучения аминокислотной последовательности часто пользуются методом Эдмана — ступен чатым расщепление.м пептида с его аминного конца с помощью фенилизотиоцианата (фиг. 7). Этот метод применим и для негидролизованных вирусных белков, если К-конец у них свободен. В настоящее время в продаже появились автоматические секвенаторы аминокислот, работающие на том же принципе. [c.73]

    Анализ аминокислотной последовательности пептвдов и белков этим методом может выполняться вручную или с помощью специальных автоматических приборов — секвенаторов, использование которых в настоящее время значительно упростило процесс аминокислотного анализа. В сек-венаторах белок в виде тонкой пленки помещают во вращающийся цилиндрический сосуд, где он подвергается реакции по Эдману. Реактивы и растворители проходят над иммобилизованной белковой пленкой, а высвобождающиеся ФТГ-АК подвергаются жидкостной хроматографии при высоком давлении и таким образом идентифицируются. С помощью сек-венатора можно определить аминокислотную последовательность полипептида или белка, содержащего до ста аминокислотных остатков. [c.60]

    ОФА был введен в программу автоматического анализа аминокислотной последовательности на секвенаторе для блокирования а-амипогрупп остаточных пептидов, когда пролин становится N-концевым в определяемой последовательности [41]. [c.280]

    Идентификация с использованием ВЭЖХ в режиме прямой стыковки секвенатора с хроматографом (<соп line ). В идеале автоматический анализ аминокислотной последова- [c.398]

    Метод тонкослойной хроматографии (ТСХ), использованный Эдманом и Бэггом и описанный в их классической работе, посвященной автоматическому секвенатору [2], наиболее прост в экспериментальном отношении, не требует дорогого оборудования, но характеризуется невысокой чувствительностью (- 1 нмоль), тех удобна как для ручного, так и для автоматического определения последовательности однако это скорее качественный, чем количественный метод. Как бесспорное достоинство метода надо отметить возможность одновременного анализа нескольких образцов. Метод можно сделать полуколичественным, элюируя ФТГ с хроматографической пластинки, но обычно это не делается. При идентификации ФТГ-Arg и ФТГ-Н з ТСХ следует дополнять другими методами — ВЭЖХ тех же ФТГ-аминокислот, или аминокислотным анализом свободных аминокислот, полученных при обратном гидролизе ФТГ-аминокислот. Следует проводить обратный гидролиз при анализе только коротких пептидов и высокоэффективном определении последовательности аминокислот средних пептидов на секвенаторе с использованием наномольных количеств образца. Для анализа ФТГ-производных аминокислот с середины 60-х годов стала использоваться газожидкостная хроматография (ГЖХ). Этим методом можно быстро и количественно определить большинство, но не все с "ГГ-производные аминокислот. В неспособности ГЖХ обеспечить однозначную идентификацию ФТГ-производных всех 20 аминокислот заклю- [c.405]

    Существует практическое руководство по одномерному анализу ФТГ-производных аминокислот методом ТСХ [3]. Большое достоинство метода заключается в возможности одновременного анализа сразу нескольких остатков, отщепленных на секвенаторе. Следует анализировать 1 нмоль образца предпочтительнее иметь дело с 50—70 нмоль. Наличие остаточных аминокислот сильно затрудняет интерпретацию результатов, поэтому для их подтверждения рекомендуется использовать второй метод. Для определения ФТГ-Arg и ФТГ-His следует проводить ВЭЖХ или ставить обратный гидролиз с последующим аминокислотным анализом продуктов гидролиза. [c.417]

    Фенилизотиоцианатный метод Эдмана (1950) реализуется в специально созданном для этой цели приборе, получившем название секвенатор (от англ. sequen e—последовательность). Принципиальная схема устройства твердофазного секвенатора и принцип его работы показаны на рис. 24. В современных моделях секвенатора удается определить чередование аминокислотных остатков не только в коротких пептидах, но и непосредственно в полипептидных цепях белка, проходя до 70 аминокислотных звеньев в его молекуле. [c.56]


Смотреть страницы где упоминается термин Аминокислотные секвенаторы: [c.288]    [c.405]    [c.370]    [c.58]    [c.62]    [c.62]    [c.63]    [c.77]    [c.124]    [c.121]    [c.155]    [c.374]    [c.464]    [c.471]    [c.479]    [c.521]    [c.526]    [c.8]    [c.58]    [c.60]    [c.32]   
Молекулярная биология клетки Том5 (1987) -- [ c.200 ]




ПОИСК







© 2025 chem21.info Реклама на сайте