Ферменты критерии чистоты

В исследованиях, посвященных изучению структуры белков, наблюдается тенденция к молчаливому предположению о том, что белки представляют собой соединения в том смысле, как понимают этот термин в органической химии, то есть что их состав является постоянным и не изменяющимся. Пири [123] рассмотрел критерии, применяющиеся для оценки степени чистоты больших молекул. Он предложил считать препарат фермента чистым тогда, когда все его частицы будут идентичны по размерам и химическому составу и каждая из них будет обладать той же активностью, что и исходный материал. [c.262]

Чистоту выделенных мембранных фракций определяют по нескольким критериям. Часто применяется морфологическое определение с помощью электронной микроскопии (см. 3.11) в случае, если мембрана обнаруживает отчетливые морфологические признаки. Более конкретная оценка чистоты мембран осуществляется посредством определения удельной активности маркерных ферментов. [c.234]

Критерий чистоты Б.-гомогенность прн электрофорезе, хроматографии и ультрацентрнфугированни. Одноцепочечный Б. должен быть гомогенным прн N- и С-концевом анализе (см. ниже). Примесь сопутствующих ферментов определяют с помощью спецнфич. субстратов высокую чувствительность имеют иммунохим. методы (обычно до 10 мкг/мл примесного антигена) [c.250]

Другой тест на чистоту вытекает из диаграммы растворимости в случае гомогенного белка вплоть до достижения точки насыщения количество добавленного и количество растворившегося белка связань линейной зависимостью. Критериями чистоты также служат аминокислотный состав, изоэлектрическая точка, а также в некоторой степеии кристаллизуемость. В случае биологически активных белков, например. ферментов, вывод о чистоте может быть сделан из критериев активности (субстратная специфичность, оптимальные pH и температура, кинетические эксперименты). [c.354]

Поскольку здесь рассматриьаются общие химические черты ферментативного катализа, мы в большинстве случаев будем избегать подобных осложнений и ограничимся, где это возможно, только простейшим типом мономерного фермента. Белок этого типа — обычно большая молекула, состоящая из одной полипептидной цепи, содержащей, возможно, несколько сот аминокислот и свободно существующая в растворе внутри клетки. Такой белок можно очистить до степени гомогенности (по нескольким различным критериям), используя хроматографические и электрофоретические методы, пригодные для разделения заряженных макромолекул в водной среде [5]. На этой стадии очистки при благоприятных условиях белок можно закристаллизовать. Многие ферменты, таким образом, становятся доступными в качестве вполне определенных органических соединений, удовлетворяющих обычным критериям чистоты, и они, естественно, могут быть синтезированы 6]. Они также могут быть получены в значительных количествах, i e хорошо изученные ферменты — например, трипсин, химотрипсин, лизоцим и рибонуклеаза — доступны в граммовых количествах. Значительное число других доступны коммерчески в миллиграммовых количествах. [c.450]

В качестве критериев чистоты ферментов используют данные электрофореза, ультрацентрифугирования (седиментограмма), определения молекулярной массы различными методами, по растворимости (кривые растворения), оценки полидисперсности с определением специфической активности каждой фракции, хроматографирования на различных носителях и в нескольких системах, аминокислотного состава (особенно — при обнаружении белковых примесей), включая секвенирование (от англ sequen e — последовательность) на автоматизированных приборах - секвенаторах, ит д [c.56]

Другим критерием чистоты является раст воримостъ, так как известно, что растворимость чистого вещества не изменяется в присутствии избытка твердого вещества. Однако применение этого метода наталкивается на ту трудность, что растворимость белков сильно изменяется в присутствии следов кислот, оснований или солей этот недостаток устраняют, применяя в качестве растворителя концентрированный солевой раствор. При этом было установлено, что некоторые белки, считавшиеся однородными, в действительности представляют собой смеси очень сходных веществ (например, яичный альбумин и карбоксигемоглобин), тогда как другие, безусловно, являются индивидуальными веществами (например, два кристаллических фермента — химотрипсиноген и рибо-нуклеаза). [c.417]

I Кривые растворимости. Одним из более надежных критериев чистоты белка является форма кривых растворимости. Кривые растворимости строят, тщательно измеряя количество белка в растворе при различных количествах белка, добавленного в раствор. Ионная сила, температура и объем раствора ДО.ИЖНЫ при этом оставаться постоянными необходимым условием является также достижение полного равновесия между твердой и растворенной фазами. Для чистого белка зависимость количества белка в растворе от количества внесенного белка строго линейна до точки насыщения после точки насыщения наклон кривой равен нулю. На фиг. 26 приведены кривые растворимости для чистого и загрязненного препаратов протеолитического фермента пепсина. Присутствие примесей может различным образом изменять идеальную кривую в зависимости от растворимости загрязняющего вещества и от его содержания в препарате. Однако и самое тщательное исследование формы [c.82]

В качестве критерия чистоты соединения пользуются также растворимостью. Известно, что растворимость гомогенного вещества постоянна и не изменяется в присутствии избытка твердого вещества. Этот метод вряд ли пригоден для определения растворимости белков в чистой воде, так как растворимость белков в воде сильно зависит от следов электролитов и от концентрации водородных или гидроксильных ионов. Влияние этих веществ можно исключить, если в качестве растворителя использовать концентрированный раствор соли. При проверке растворимости кристаллического яичного альбумина или карбокси-гемоглобина в растворе сернокислого ам1мония было найдено, что растворимость до некоторой степени зависит от количества твердой фазы [22]. На этом основании было сделано заключение, что молекулы этих белков можно рассматривать как системы обратимо диссоциирующих компонентов. Очень тщательные определения растворимости кристаллического химотрипсиногена [23] и рибонуклеазы [24] показали, что эти белки ведут себя как гомогенные соединения. В высшей степени важно, что эти гомогенные белки являются ферментами (см. гл. ХП). [c.15]

Удаление низкомолекулярных веществ еще не приводит к окончательной очистке ферментов. Более радикальным приемом является осаждение ферментов этиловым спиртом определенной концентрации, ацетоном и другими водоо гнимающими реактивами с последующим извлечением их из осадков водою. Во всех приемах очистки ферментов критерием степени чистоты является активность их действия. Активность фермента в весовой части исходного материала принимается за единицу. Чем больше очищен фермент, тем больше его активность на единицу веса его препарата. В отдельных случаях можно было повысить активность ферментов в 2000 раз и больше по сравнению с активностью исходного материала. К эффективным приемам очистки ферментов относится связывание их на поверхности раздробленных частичек твердых веществ (адсорбция) с последующим освобождением (элюирование), а также отделение их от других веществ методом хроматографии. Следует, однако, указать, что эти приемы очистки ферментов обычно не приводят к их кристаллизации и они используются только при предварительной очистке ферментов. Весьма ценным в очистке ферментов оказался метод высаливания их нейтральными солями щелочных металлов, особенно сернокислым аммонием. Метод высаливания позволил получить целый ряд ферментов в кристаллическом виде. Часто для очистки ферментов приходится прибегать к различным приемам, и заключительным звеном работы является их высаливание. [c.176]

Значительные усилия были направлены на развитие методов асимметрического синтеза а-аминокислот (когда необходимая хи-ральность вводится в ходе синтеза с помощью хиральных реагентов) [55]. На схеме (18) [56] приведен особенно успешный пример перспективного метода (см. также гл. 23.2). Тем не менее асимметрический синтез все еще представляет более академический нежели практический интерес, и синтетическая работа в этой области обычно требует последующего разделения оптических изомеров. Разделение диастереомерных производных и использование избирательных ферментов (особенно ацилаз, которые могут гидролизовать только одну из двух энантиомерных ациламинокислот) стали классическими методами [57]. Эти методы все еще заслоняют другие подходы, такие как хроматографию на оптически активных средах и предпочтительную кристаллизацию. Среди многих приемов, использующих диастереомерные производные, особого упоминания заслуживает тирозин-гидразидный метод [58] схема (19) . Естественно, здесь особенно важны критерии оптической чистоты [59], Как это ни звучит парадоксально, но в ТОН [c.240]

Каждый биохимик, получив исследуемый фермент в кристаллическом виде, испытывает большое и вполне законное удовлетворение. Однако не следует забывать, что одна только кристаллизация фермента не может служить полной гарантией его чистоты. Так, Джекоби, в лаборатории которого за три года было выделено в кристаллическом виде 50 белков [7], сообщил о кристаллизации препаратов всего лишь 30%-ной чистоты. Он еще раз подчеркнул необходимость применения иных критериев гомогенности, таких, например, как ультрацентрифугирование и электрофорез. Однако следует иметь в виду, что при некритичном отношении к постановке эксперимента и на ультрацентрифуге можно получить один пик для гетерогенной смеси. На скорость седиментации частиц в центробежном поле и характер получающихся на седиментационных диаграммах пиков влияет ряд факторов, которые рассматриваются в настоящей книге и которыми некоторые исследователи часто на собственный риск пренебрегают. Именно по этой причине, несмотря на большие возможности применения этого метода в упомянутых выше областях, во многих лабораториях к работе на ультрацентрифуге допускается лишь ограниченный круг лиц, умеющих правильно использовать приборы и интерпретировать получаемые данные. Люди, владеющие этими знаниями, охотно принимаются в исследовательские коллективы, и можно надеяться, что предлагаемая книга послужит увеличению числа таких специалистов. Материал, изложенный в данной книге, рассмотрен достаточно глубоко, но вместе с тем не слишком сложно, что является результатом многолетнего опыта замечательного лектора, читающего курс физико-химических концепций студен-там-биохимикам. [c.10]

Ввиду неопределенности критериев и трудности определения чистоты белка целесообразно выбрать другой путь исследования, а именно сравнительный анализ. Этот метод позволяет обнаружить, какие группы определяют функцию одинаковых белков (например, инсулина) различных биологических видов. Такой метод исследования имеет большое преимущество, если его сочетать с изучением ингибирующего действия. Еще одним путем исследования может быть анализ белков, близких по выполняемым функциям. Например, вое ферменты гликолитического цикла являются более или менее исследованными для каждого последующего фермента субстратом является продукт, образующийся в результате действия предыдущей системы ферментов. Сравнение тех ферментов гликолитического цикла, которые катализируют перенос атомов водорода (например, изомераза) или фосфатных групп (например, гексокиназа, фосфогексокиназа и дифосфогли-церофосфокиназа), представляло бы особый интерес, потому что каждая такая группа ферментов может иметь много общих структурных особенностей. С этой точки зрения можно рассматривать также соответствующие ферменты гликолитического цикла в дрожжах и мышцах. [c.251]

С целью преодоления недостатков вышеуказанного метода для оценки чистоты мембранных фракций удобнее использовать не ферменты, а специфические рецепторы лектинов, гормонов, антител, В том случае, если мембрана имеет четкие морфологические признаки, в качестве критерия применяют метод электронной микроскопии. Если хорошо изучен химический состав определенного типа мембран, то для контроля чистоты мембранных структур используют анализ белкового и липидного состава (например, методом электрофореза в ПААГ в присутствии ДСН или путем определения содержания холестерина). [c.223]

Фермент был тщательно очищен. Ряд критериев свидетельствовал о его чистоте ОН давал один пик при хроматографии, электрофорезе или центрифугировании в различных условиях. При анализе методом ДСН-элек-трофореза получилось две зоны, причем площадь одной была в 2 раза больше, чем другой. Какую информацию о белке можно получить из этого факта Поскольку чистоту всегда трудно удостоверить, считаете ли вы, что пред-полоя ение было правильным (Что может дать в этом случае гель-проии-кающая хроматография ) [c.246]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология