Иммунопреципитация, метод

Рис. 4.6. Основные методы иммунопреципитации в геле.

Принцип метода. Иммуноэлектрофорез представляет собой комбинацию электрофоретического разделения белков с двойной диффузией и иммунопреципитацией в геле. Вслед за электрофоретическим разделением белков в агаровом геле навстречу полученным фракциям диффундирует специфическая иммунная сыворотка. Этот метод позволяет характеризовать белки не только по скорости миграции в электрическом поле, но и по антигенным свойствам. [c.137]

Вильямсон и Аллисон [13] сделали попытку усовершенствовать стадию иммунопреципитации с помощью метода Лорелла [63], заключающегося в проведении электрофореза антигена в гелях агарозы, включающих антитела. Согласно предложенной методике, белки после разделения переносят на полоску фильтровальной бумаги, которую затем помещают на слой агарозы с антителами, и проводят электрофорез. Таким путем в сыворотке мыши удалось обнаружить до 20 компонентов [13, 64 В другом варианте удаляют лишний сефадекс по Хансону [14 а затем осторожно переносят весь гель агарозы с антителами на полоску сефадекса. По такой методике выполнен анализ молекулярновесового распределения а-липопротеина нормальной сыворотки [65], приведенный на рис. 9. [c.275]

Титр антисыворотки сильно зависит от концентрации антигена, используемого дл я тестирования и от способа его определения. Например, одна и та же сыворотка может иметь титр 100 в тесте иммунопреципитации и 100 000 в тесте иммуноферментного анализа. Поэтому при тестировании сыворотки и определении титра лучше всего применять тот же метод, что и при анализе, а концентрацию антигена выбирать близкую к минимальной в том диапазоне, который выбран для анализа. Кроме того, следует учитывать, что в иммуноферментном анализе используют как гомогенные, так и гетерогенные методы определения концентрации антигена, которые могут сильно отличаться по структуре образующихся иммунных комплексов. В частности, в твердофазных методах вероятность образования циклических комплексов антиген — антитело значительно меньше, чем в гомогенных, а следовательно, и Наблюдаемая аффинность антител в обеих системах будет разная. [c.158]

В данных методах совмещены электрофоретическая миграция антигенов в агарозе с последующей иммунопреципитацией в геле. В результате первого процесса происходит частичное разделение смеси антигенов, поскольку скорость их миграции в геле зависит от суммарного заряда при данном рП буферного раствора. Кроме того, отрицательно заряженные молекулы быстро мигрируют в гель, содержащий антитела, что ускоряет преципитацию и сводит к минимуму латеральную диффузию. [c.215]

Рассмотрение различных вариантов иммуноэлектрофореза естественным образом завершает начатое еще в предыдущей книге изложение методов фракционирования белков и нуклеиновых кислот в электрическом поле. В любом из вариантов иммуноэлектрофореза обязательно имеет место явление иммунопреципитации. Это явление широко используется и само по себе — как плодотворный способ высокоизбирательной очистки белков, а также для обнаружения иммуноспецифических продуктов фракционирования, проведенного с помощью обычного электрофореза или ИЭФ. Поэтому представляется целесообразным предварить рассмотрение собственно иммуноэлектрофореза описанием механизма и особенностей метода иммунопреципитации. Однако многие из этих особенностей, в частности очень важные явления неоднозначности иммунного ответа и полиморфизма иммунных реакций, нельзя понять без хотя бы беглого, но не слишком поверхностного знакомства С механизмом выработки иммунитета, строением я функцией иммуноглобулинов, природой сил взаимодействия между антителами и антигенами и т. д. Эти же представления окажутся необходимыми в следующей части книги при рассмотрении радиоиммунных методов исследования. Между тем в большинстве случаев биохимики и молекулярные биологи довольно плохо знакомы с современной иммунохимией, претерпевающей к тому же пору бурного развития. [c.81]

На стыке гелей ПААГ и агарозы в силу заметного различия степени эндосмоса может иметь место смазывание линий иммунопреципитации и искажение ее картины, поэтому используют специальный метод наложения полосы ПААГ на гель агарозы. Последний формируют из двух частей. У края пластины, который впоследствии будет обращен к катоду, заливают слой геля агарозы без антисыворотки с таким расчетом, чтобы он был на несколько миллиметров шире, чем полоса ПААГ, которую предстоит уложить на этот слой вровень с наружным его краем. Вплотную к пустому слою агарозы на остальной площади пластины слоем такой же толщины формируют гель агарозы в смеси с антисывороткой. Линия раздела двух слоев должна быть параллельна катодному краю пластины и ориентированной по нему полосе ПААГ. Переносить и накладывать эту последнюю на гель агарозы удобно с помощью упомянутой выше тонкой металлической пластинки. Перед наложением пластинку следует повернуть полосой геля к себе, а затем перевернуть гелем вниз и таким образом уложить его на поверхность агарозы. Электродные фитили накладывают на наружный край полосы ПААГ (катодный) и на противоположный край пластины геля агарозы. В ходе электрофореза во втором направлении антигены из ПААГ переходят в гель агарозы и далее мигрируют в ней, образуя пики преципитации. Различие степени эндосмоса в этом случае никаких проблем не создает. [c.151]

Общим подходом для всех рассматриваемых ниже радиоиммунных методов является преципитация (или сорбция) иммунного комплекса, в котором один из партнеров радиоактивен. При этом используются новые методы иммунопреципитации, не нуж- [c.269]

При введении животному чистого белка вырабатываемые антитела специфичны только для этого белка. В таком случае получают моносиецифичную антисыворотку (см. рис. 4.2). Следует отметить, что иммунизация очищенным белком не всегда дает такой результат. Примеси, присутствующие в очищенной фракции, если они достаточно иммуногенны, могут вызвать образование антител. Чрезвычайно важно удостовериться, что антисыворотка моноспецифична до использования ее при определенных методах (в сущности, ири всех описанных здесь методах, за исключением методов иммунопреципитации в геле) это исключит возможность участия в реакции неспецифических антител. Неспецифические антитела чаще появляются при длительных процессах иммунизации. [c.96]

В целях определения D-антигенов используют 3 главных метода с моноклональными антителами иммунофлуоресцентный, иммуноосадочный (иммунопреципитация) и иммуногистологический на тканевых срезах. К началу 90-х годов было определено 78 D-антигенов ( D1— D78), часть из которых представлена в таблице 59. [c.567]

Сочетание иммунодиффузии с гель-фильтрацией в тонком слое представляет собой чувствительный метод, напоминающий и дополняющий иммуноэлектрофорез. Далее мы называем этот метод имм шо-гель-фильтрацией, хотя были предложены и другие термины, например, иммунохроматография [17, 53] и гелевая иммунофильтрация [54]. Известно несколько вариантов этого метода 13—15, 17, 53—55]. Грант и Эвералл [54] проводили иммунодиффузию в слое сефадекса. Хотя в цитируемых здесь работах приводятся отличные спектры иммунопреципитации, эта методика, как отмечают сами авторы, имеет ряд недостатков [56, 57]. [c.271]

Носителями в данном случае чаще всего служат ацетат целлюлозы [26] и гели агарозы [4]. Разрешающая способность таких систем очень низка из-за чрезмерного диффузионного размывания зон. Применение в качестве носителя крахмального или полиакриламидного геля значительно повышает разрешающую способность прежде всего благодаря молекулярно-ситовому эффекту. Иммуноэлектрофорез [56] является одной из разновидностей зонного электрофореза при постоянном значении pH после разделения белки диффундируют навстречу специфическим антителам и их взаимодействие приводит к образованию дуг иммунопреципитации. Полуколичественную оценку каждого антигенного компонента можно выполнить методом электроиммунодиффузии [57]. После разделения методом зонного электрофореза антигенные белки электрофоретически мигрируют в направлении, перпендикулярном прежнему пути, в гель, содержащий равномерно распределенные антитела. Высота образующихся пиков преципитации является мерой относительной концентрации белков в смеси. [c.120]

Методом иммунопреципитации белок S-100 был обнаружен и в ядрах HeiiponoB (Hyden, M Ewen, 1966). Асимметрия в распределении белка S-100 привлекает внимание при выяснении функциональной роли кислых белков. [c.138]

Очень важно установить, имеются ли в сыворотке иммунизированной мыши антитела к белкам, кодируемым вставочными последовательностями. Для этого используют ряд подходов в зависимости от того, насколько легко получить полноразмерный нативный продукт ОРС. Если известно, что ОРС экспрессируется в культивируемых клетках определенной линии или что ее продукт в достаточном количестве присутствует в определенной ткани, тогда можно определить активность сыворотки в отношении данных клеток или тканей с помощью иммуноци-тохимических методов, иммунопреципитации или вестерн-блот-анализа. По нашим данным, при работе с ОРС млекопитаю- [c.182]

Моноклональные антитела могут эффективно использоваться в иммунопреципитации и в иммуноцитохимических методах. На ранних этапах наших исследований при использовании и того, и другого метода мы сталкивались с трудностями из-за повышенного фонового сигнала, который отсутствовал при использовании поликлональных антител. Нам удалось преодолеть эти затруднения в табл. 6.7 и 6.9 приводятся соответствующие методики, которые, как мы обнаружили, во многих случаях хорошо работают. [c.196]

Берзине и др. [114] методом перекрестного иммуноэлектрофореза изучали антигены из микросом печени крысы, обладающие эстеразной активностью. Солюбилизацию белков осуществляли с помощью детергентов люброла и дезоксихолата. Вначале проводили ИЭФ (pH 3—7), а затем иммуноэлектрофорез в агарозном геле, содержавшем 10% кроличьей антисыворотки к микросомам печени крысы. Эстеразы идентифицировали по ферментативной активности согласно методу Уриэля [1323] (см. гл. II.6). В эстракте, полученном с помощью детергентов, обнаружили по меньшей мере 20 зон неспецифических эстераз, большинство из которых имели ИЭТ в интервале pH 4,5—6,5. При иммуноэлектрофорезе выявлено не менее 5 полос иммунопреципитации, обладающих выраженной микрогетерогенностью. [c.318]

При механической желтухе в плазме больных обнаруживается особый липопротеид (Lp-X), который по своей плотности принадлежит к ЛНП и обладает характерным липидным и белковым составом. Выявление Lp-X на электрофореграмме основано на его миграции к катоду при обычных условиях электрофореза в агаровом геле. Для увеличения катодной подвижности Lp-X пластины агарового геля необходимо выдерживать перед электрофорезом не менее 6 ч [990, 1166]. Надежная локализация этого белка стала возможной благодаря применению специфических антисывороток [1164]. Петек и др. [990] сравнили три различных способа проведения иммунопреципитации. При первом способе антисыворотку помещают в канавки, подобно тому как это делается при иммуноэлектрофорезе по методу Шайдеггера. Во втором способе после электрофореза в геле вырезают круглые лунки для антител на расстоянии 4 мм от лунок для антигена. В обоих случаях время, необходимое для диффузии, составляет 12—16 ч. Второй способ является более экономным с точки зрения расходования антисыворотки. При использовании третьего способа (иммунофиксация) антисыворотку прямо наносят на поверхность геля на расстоянии [c.355]

Антисыворотки к растворимым антигенам можно исследовать с помощью обычных методов иммунопреципитации. При этом более оптимальными условиями для преципитации будет половинная ионная сила буферов, используемых обычно в работе с млекопитающими (Roth, S hneider, 1971). Если имеются [c.487]

Вначале при разработке метода ЭИЗ электрофоретическому разделению подвергали очищенные и гомогенные белкн или же белковые смесн, а затем для ориентировочной локализации молекул с разным зарядом применяли иммунодиффузию. Перед электрофорезом с изменением заряда ие рекомендуется проводить ДСН-ПАГЭ, поскольку при этом белки могут подвергаться денатурации с обнажением внутренних гидрофобных областей. Чтобы повысить разрешающую способность электрофоретического анализа, мы сначала проводили ЭИЗ, а затем, вырезав нужные участки геля, элюировали белки и подвергали их иммунопреципитации и ДСН-ПАГЭ. Иными словами, мы сочетали фракционирование нативных образцов по гидрофобно-сти в ЭИЗ с иммунопреципитацией и разделением по величине молекул в ДСН-ПАГЭ, что позволяет отнести всю процедуру к методам двумерного электрофоретического разделения. [c.85]

Описаны методы количественного автоматического анализа люминала, теофиллина, тобрамицина и гентамицина при помощи гомогенной иммунопреципитации (Wu et al., 1982, 1983). В этих методах лекарственный препарат, содержащийся в образцах, конкурирует с конъюгатом [лекарственный препарат— альбумин] за связывание с антителами. Количество осажденного комплекса [лекарственный препарат — альбумин — антитела] можно измерить после инкубации в течение 3 мин. [c.54]

В работе (Foo et al., 1981) проводили сравнение нескольких методов, рекомендуемых Ассоциацией клинической биохимии, с помощью которых можно выявлять различия между сыворотками больных с заболеваниями сердца и печени. Сравнивали следующие методики иммунохимическое определение (тест Isomune LD), электрофорез, определение а-гидроксибутиратде-гидрогеназы, определение ЛДГ, устойчивой к действию мочевины, или термостабильной ЛДГ. Наиболее достоверные резуль -таты удавалось получать при определении ЛДГ-1 с помощью иммунопреципитации. Этому методу несколько уступали методы, основанные на определении термостабильной ЛДГ и на электрофоретическом определении ЛДГ-1. Фиксация а-оксибу тиратдегидрогеназной активности или ЛДГ, устойчивой к мочевине, не давала статистически заметного выигрыша по сравнению с определением общего уровня ЛДГ. [c.325]

После того, как было выяснено большое значение для клиники определения МВ-изофермента креатинкиназы, стали детально исследовать иммунохимические особенности изоферментов креатинкиназы, В результате этих исследований был разработан целый ряд методов определения КК-МВ, в том числе ИА, иммуноингибирование, сэндвич-иммуноанализ и высокоспецифичный иммунохимический метод (Isomune СК). Из-за особенностей строения изофермента КК-МВ, состоящего из субъединиц двух типов, его избирательное определение достигается только при использовании сэндвич-иммуноанализа с применением антител против КК-ВВ и КК-ММ, а также иммунохимического анализа, основанного на сочетании иммуноингибирования и иммунопреципитации. Ввиду того что различные аномальные изоферменты креатинкиназы распространены достаточно широко, подобная избирательность представляется весьма важной характеристикой метода определения КК-МВ. [c.337]

Среди таких вариантов в первую очередь можно назвать метод ИЭФ, подробно описанный в части I. Манипуляции с полоской геля агарозы после ИЭФ точно такие же, как в случае электрофореза, если не считать операции перевода геля в веронало-вый буфер путем вымачивания его в двух-трех сменах этого буфера, по 15 мин в каждой. Характерные для ИЭФ узкие белковые зоны при этом немного расширяются за счет диффузии, но наглядность картины перекрестного иммуиоэлектрофореза от этого не страдает. Амфолиты можно вымывать не полностью, так как они не мешают иммунопреципитации. [c.149]

Назначение ДОХ-Na — способствовать выходу белков из ПААГ в агарозу. При pH 8,6 ДОХ-Na заряжен отрицательно и мигрирует через полоску ПААГ в направлении анода. Образованию иммунного комплекса он не мешает. В гель агарозы с антителами был введен еще и полнэтиленгликоль в концентрации 4%. Замечено, что он способствует иммунопреципитации и в несколько раз увеличивает чувствительность метода. [c.150]

Аллоспецифичные структурные мотивы в молекулах пептидов, элюированных из комплексов с молекулами МНС класса I гаплотипа Н-2КЬ или Н-2К . Молекулы МНС вьщеляли методом иммунопреципитации. Связанные с ними пептиды были очищены и секвенированы. Якорные аминокислотные остатки, наиболее часто встречающиеся в определенных позициях, определены как доминантные, а встречающиеся лишь относительно часто - как функциональные. В позициях без указания определенной аминокислоты с равной вероятностью встречается несколько различных остатков. Для обозначения аминокислот использован однобуквенный код. Вверху изображены пептидсвя-зывающие полости (вид сверху) двух молекул МНС класса I разных гаплотипов. Позиции якорных остатков в составе пептида, связанного с молекулой МНС каждого гаплотипа, выделены цветом. [c.162]

Смотреть страницы где упоминается термин Иммунопреципитация, метод: [c.500] [c.277] [c.299] [c.186] [c.135] [c.143] [c.172] [c.179] [c.235] [c.265] [c.355] [c.184] [c.197] [c.78] [c.278] [c.270] [c.272] [c.276] [c.277] [c.172] [c.179] [c.532] [c.536]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология