Галактозидаза, выделение

Всего лишь 40 лет назад мысль о том, что ген можно включать или выключать, казалась абсурдной. Гипотеза, сыгравшая такую важную роль в понимании работы клеток, была выдвинута на основании изучения Е. соИ, растушей на смеси глюкозы и лактозы (дисахарид). Если бактерии предоставляли выбор источника углерода, она сначала использовала всю глюкозу и лишь затем начинала метаболизировать лактозу. Переключение на лактозу сопровождалось остановкой роста, в течение которой синтезировался фермент Р-галактозидаза, гидролизирующий лактозу до глюкозы и галактозы. Выделение и характеристика мутантных бактерий, обладающих определенными дефектами в регуляции такого переключения, дало толчок биохимическим исследованиям, которые в 1966 г. привели к идентификации и вьщелению белка-репрессора лактозного оперона. [c.183]

Экстракты, выделенные, как описано в разд. 5.3.2 (п. 2, 3 или 4), могут быть непосредственно нанесены на аффинные колонки, содержащие антитела к -галактозидазе без какого-либо предварительного фракционирования (например, удаления нуклеиновых кислот). Поэтому гибридные белки, характеризующиеся низкой стабильностью или низким содержанием в клетке, могут быть легко выделены из разбавленных экстрактов без деградации, возможной при более длительных методах выделения. [c.157]

Изучение генетического контроля утилизании лактозы в клетках Е. соИ привело исследователей к выводу о существовании белка-репрессора, который в отсутствие лактозы в среде выключает синтез Р-галактозидазы. Выделение, очистка этого белка и использование его в опытах in vitro позволили расшифровать механизм гакой регуляции. Оказалось, что репрессор ингибирует транскрипцию 1ас-оперона, связываясь с так называемым оператором - последовательностью ДПК длиной 21 нуклеотид, которая перекрывается с расположенным по соседству участком связывания РПК-полимеразы (промотором). До тех пор, пока репрессор [c.184]

Морроу и др. [23] разработали иолуколичественную теорию неспецифического связывания белков на замещенных хроматографических аффинных носителях, которое обусловлено электростатическими и гидрофобными взаимодействиями. В разд. 5.1 детально рассмотрено выделение р-галактозидазы из Es heri hia соИ, проводимое на сефарозе с прикрепленным ингибитором (п-аминофе-нил-р-о-тиогалактопиранозидом) [31]. Активный сорбент получали присоединением ингибитора через пространственную группу, полученную из бис-(3-аминопропил) амина и янтарного ангидрида. Однако активность сорбента была значительно ниже, если эта пространственная группа обладала гидрофильными свойствами [26]. Робинсон и др. [29] использовали аффинный сорбент, при- [c.95]

В качестве аффинных лигандов можно использовать любые соединения, прочно, специфично и обратимо связывающиеся с выделяемым веществом. Химическое строение аффинных лигандов может быть самым различным. Поскольку в настоящее время метод аффинной хроматографии применяется главным образом для выделения ферментов и их ингибиторов [89J, мы рассмотрим примеры, взятые из этой области. Как уже упоминалось, при выделении фермента аффинными лигандам1И могут служить его ингибитор, аналогичный субстрату, а также эффектор, кофактор и в отдельных случаях даже субстрат. Это справедливо и для фермента, требующего длл реакции два субстрата, но способного достаточно сильно связываться только с одним из них. Субстрат также можно использовать для адсорбции фермента в таких условиях, когда фермент связывается, но сам не способен катализировать реакцию (например, в отсутствие ионов металлов, необходимых для реакции), а также когда константа Михаэлиса зависит от pH или температуры. Аффинный адсорбент для выделения белков обычно трудно получить из аффинного лиганда, если константа диссоциации его комплекса с белком превышает (0,5—1,0)-Ю [16]. Однако Стире и сотр. [84] показали, что очень эффективный адсорбент для р-галактозидазы можно получить даже из такого относительно слабого ингибитора, как н-аминофенил-р-о-тиогалактопирано-зид (/i , 5-10 ). Этого удается достигнуть, повышая концентрацию нерастворимого аффинного лиганда и увеличивая расстояние между аффинным лигандом и матрицей носителя, что приводит к максимальной доступности аффинного лиганда, для белка в растворе. [c.9]

Применение акриламидных гелей в аффинной хроматографии в настоящее время весьма ограниченно. Куатреказас [14] показал, что выделение относительно малой молекулы нуклеазы стафилококков можно проводить не только на сефарозе, но и на биогеле Р-300, однако для выделения больших молекул, например р-галактозидазы [84], этот гель мало пригоден из-за низкой пористости. [c.39]

Далее был выделен другой мутант о , ведущий себя как конститутивный, но притом не лишенный вещества ренрессора, т. е. i" . Конститутивность проявлялась нри образовании зиготы, но только по отношению к тем цистронам, которые находятся в положении is относительно точки о =. Например, скрещивание Hfry z"o i X F"y z o =i приводило к зиготе, в которой синтез галактозидазы конститутивен, ибо F являлась мутантом о и цистрон Z+ расположен в той же хромосоме, т. е. в положении is относительно о . Одновременно в тех же клетках синтез нер-меазы оказывался индуцированным, так как цистрон у " находился во второй хромосоме, в которой оператор был в аллели о" ". [c.493]

В первых опытах Мишера по выделению нуклеина из клеток гноя, проведенных около века назад, было установлено, что в ядрах эукариотов отрицательно заряженная ДНК находится в комплексе с примерно равным по массе количеством положительно заряженных основных белков. В своей работе, проведенной в начале века, Коссель установил не только природу химических компонентов ДНК, но также выяснил состав связанных с ДНК основных белков. Из этих белков наиболее важное значение имеют гистоны, которые представляют собой полипептидные цепи длиной от 50 до 200 аминокислотных остатков. Положительный заряд ги-стонов обусловлен высоким содержанием в них трех основных аминокислот аргинина, лизина и гистидина, в боковых цепях которых имеется вторая аминогруппа (фиг. 15) па их долю приходится почти 25% всех аминокислот гистонов. Интересно сравнить высокое содержание основных аминокислот в гистонах с данными об аминокислотном составе различных белков, представленными в табл. 2, из которых видно, что основные аминокислоты составляют лишь от 8 до 12% всех аминокислотных остатков таких белков, как р-галактозидаза, А-полипептид триптофан-синтазы Е. oli и бычий инсулин. Взаимодействие между ДНК и гистонами в хромосоме происходит, вероятно, благодаря образованию ионных связей между фосфатными группами полинуклеотидной цепи и боковыми аминогруппами полипептидной цепи. На долю ДНК и гистонов приходится около 3 всей массы большинства хромосом остальную часть обычно относят на счет негистонных белков и РНК. [c.498]

Используя другие условия гидролиза (0,05 н. серная кислота, 120°, 2 час), Спиро [27] выделил сходный дисахарид, содержащий галактозу и N-ацетилглюкозамин, расщепляющийся -галактозидазой, но нечувствительный к мягкой обработке щелочью. По хроматографической подвижности он соответствовал 2-ацетамидо-2-дезокси-4-(0-р-в-галактопиранозил)-в-глюкозе (N-ацетиллактозамину) — соединению, которое было выделено из смеси продуктов мягкого кислотного гидролиза некоторых других глико-протеинов сыворотки [36, 37]. Этот дисахарид при опрыскивании трихлорацетатом бензидина дает окрашивание того же оттенка, что и N-ацетиллактозамин. Выход N-ацетиллактозамина из фетуина составляет 10% теоретического, что соответствует примерно половине количества этого вещества, выделенного из орозомукоида, однако при этом условия гидролиза были иными [36]. Выделен также деацетилированный дисахарид, но в значительно меньшем количестве. Кроме того, были получены олигосахариды, содержащие маннозу и глюкозамин, в которых последний был редуцирующим концевым остатком [38]. [c.64]

Окончательное доказательство существования в-галактозы как компонента очищенного -кислого гликоиротеина было получено путем выделения, после мягкого гидролиза, кристаллической 2-ацетамидо-2-дезокси-4-0-(Р-в-галактопиранозил)-а-в-глюкозы и ее кристаллического, полностью ацетилированного производного [31]. Дополнительные доказательства были получены окислением в-галактозооксидазой [81] и расщеплением гликопротеина чистой р-галактозидазой [82]. [c.78]

Альтернативные методы скрининга космидных библиотек, описанные в гл. 3, предполагают селекцию космидных клонов с использованием феномена гомологичной рекомбинации in vivo. Остальные главы книги посвящены вопросам, связанным с экспрессией клонированных генов. Для многих белков млекопитающих удалось осуществить высокопродуктивную внутриклеточную экспрессию в Е. oli. Однако гетерологические белки, локализующиеся в цитоплазме, часто образуют трудно растворимые агрегаты, что значительно осложняет получение нативного продукта. В гл. 4 описаны эффективные способы выделения активных растворимых продуктов из нерастворимых белков цитоплазмы Е. соИ. Вероятность деградации специфическими бактериальными протеиназами многих эукариотических белков, синтезируемых в Е. oli, может быть существенно снижена, если их экспрессировать в виде гибридных белков. Такие составные белки, в которых бактериальный компонент обычно представлен -галактозидазой, можно использовать в качестве иммуногенов для получения антисыворотки и моноклональных антител к клонированному эукариотическому белковому домену. Эти вопросы >ассматриваются в двух главах — одна посвящена получению поликлональной антисыворотки, а другая — методам гибридной технологии. В последующих главах книги описаны современные эукариотические экспрессирующие системы в гл. 7 — дрожжевая, далее в трех главах — системы на основе культивируемых клеток млекопитающих и трансгенные животные. В частности, описана система экспрессии с использованием векторов, которые несут гены, обеспечивающие возможность их индуцибельной амплификации это позволяет снимать токсическое действие антибиотиков, введенных в культуральную среду. Клонированные в таком векторе гены также [c.8]

Гибридный белок САТ-кальцитонин [20] (табл. 4.11) был сконструирован так, чтобы его можно было очистить субстрат-аффинной хроматографией. Когда обнаружилось, что гибридный белок находится в нерастворимом состоянии, стало очевидным, что этот подход неприемлем. Другие гибридные белки, приведенные в табл. 4.11, были также сконструированы с расчетом на очистку с помощью аффинной хроматографии. Для выделения составного белка -галактозидаза-Х использовали -aминoфeнил- -D-тиoгaлaктoзид (субстратный аналог -галактозидазы [27]) и белок А, специфически связывающийся с фрагментом F иммуноглобулина G [28]. Эти гибридные белки, синтезируемые в клетках Е. oli, растворимы метод их очистки описан в разд. 4.4. [c.113]

В клетках Е. oli была осуществлена также экспрессия белков, содержащих большое число субъединиц, и осуществлено их выделение из нерастворимых комплексов. Для получения мутантных гемоглобинов осуществляли синтез в клетках Е. соИ Р-глобина в виде гибридного белка р-галактозидаза — р-глобин и выделяли этот белок методом, описанным в разд. 4.3.2.2 [23] (табл. 4.10). После расщепления гибридного белка, диализа и лиофилизации конформацию гемоглобина восстанавливают, используя следующую методику [23]. [c.125]

Возможность экспрессии клонированных эукариотических генов в клетках Е. соИ способствовала углубленному изучению множества белков, представляющих интерес для фундаментальных научных исследований и медицины. В тех случаях, когда нативный негибридный белок экспрессируется недостаточно эффективно, часто экспрессия белков или их фрагментов в виде гибридов с полипептидами Е.соИ, такими, как -галактозидаза, оказывалась более успешной. К тому же гибридные белки можно легко очищать с помощью хроматографических методов, разработанных для -галактозидазы. Эукариотические белки, экспрессируемые в составе гибридных продуктов, были с успехом использованы при изучении иммунологически важных участков поверхностных антигенов [1], функций рекомбинантных полипептидов [2], при получении иммунологических зондов, необходимых для исследования ранее не изученных антигенов [3—6], для экспрессии вариантных форм белковых субъединиц и для выделения и исследования клонов ДНК из экспрессирующихся библиотек генов [8—10]. Технология работы с экспрессирующими векторами достигла столь высокого уровня развития, что стало возможным осуществлять в клетках Е. соН достаточно эффективную экспрессию практически любой кодирующей последовательности с образованием гибридного продукта, который можно выделить с помощью разнообразных биохимических методов и использовать его либо в различных функциональных исследованиях либо в качестве иммуногена. Синтез чужеродного полипептида в виде гибридного белка с -галактозидазой, по всей вероятности, значительно увеличивает стабильность этого полипептида в клетках Е. соИ. По-видимому, стабильность белка, а не сила промотора — наиболее важный фактор для успешной экспрессии рекомбинантных белков в бактериях. [c.138]

Антитела выделяют, как описано в табл. 5.7. Поскольку фракция антител, специфичных к геторологичному фрагменту гибридного белка не связывается с колонкой, ее собирают без значительных потерь, промывая колонку PBS. Элюируемая фракция антител, специфичных к -галактозидазе, служит хорошим контролем в опытах, где используются антитела к гибридным белкам, и может применяться для приготовления аффинных колонок для выделения гибридных белков (см. ниже). [c.165]

Выделение генов. Выделение одного гена из многих сотен или тысяч других генов, составляющих геном,—-очень трудная задача. Впервые ее удалось решить в 1969 г. ученым Гарвардской медицинской школы в США под руководством Дл<. Беквитса. Была использована способность фагов интегрировать в хромосомы бактерий. Два родственных фага — лямбда (X) и фи (ср) 80 интегрировались в разных точках хромосомы Е. соИ. Предварительно в соседние точки был транслоцирован ген, контролирующий фермент р-галактозидазу (la — область). Транслокация в одну из точек была совершена с инверсией, т. е. переворотом гена на 180°. Фа-ги-трансдуктанты с захваченными генами отщеплялись и размножались в чистом виде. Затем у каждого из них разделили двойную спираль ДНК на отдельные нити. Две одноименные нити обоих фагов соединяли вместе. Поскольку ген la (З-галактозидазы к одному из фагов был прикреплен с переворотом, в пределах этого гена соединялись комплементарные, т. е. разноименные, цепи. При 1 ибридизации они образовывали полноценную двойную спираль ДНК. Эта двойная спираль оказывалась очень небольшой, она составляла примерно только V12 общей длины фага-трансдуктанта, большая же часть одноименных и некомплементарных нитей оставалась несвязанной. Под действием специального фермента, дей- твyющeгo только на однониточную ДНК, эти нити отделялись ц получался чистый ген р-галактозидазы — кусочек ДНК величиной 1,4 мкм. Эксперименты по выделению генов продолжаются, разрабатываются новые, более совершенные методы этой операции. [c.166]

Исследования выделенных вакуолей (Калифорнийский университет США) показали, например, что вакуоли из эндосперма прорастающих семян клещевины содержат до 25% всего количества белка в клетке, 62% сахарозы и различные гидролитические ферменты кислую иротеазу, карбопептидазу, фос-фодиэстеразу, р-галактозидазу и др. [c.64]

Рис. 8-2. Результаты опытов с тремя различными гибридными белками (задача 8-6). А. Электрофоретическое выделение радиоактивной Р-галактозидазы, полученной путем осаждения с помощью антител, N-кoнцeвыe аминокислоты указаны над каждым столбиком. Б. Динамика деградации Р-галактозидазы после завершения синтеза белка. Уровень Р-галактозидазы выражается в процентах от начального количества, имевшегося сразу после остановки синтеза белка.

Смотреть страницы где упоминается термин Галактозидаза, выделение: [c.56] [c.270] [c.228] [c.400] [c.400] [c.304] [c.213] [c.64] [c.157] [c.8] [c.477] [c.8] [c.269] [c.271] [c.85] [c.109] [c.129] [c.139] [c.157] [c.164] [c.173] [c.165] [c.259] [c.165] [c.365] [c.306]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология