Концевые группы полинуклеотидной цепи

Нуклеотиды соединены в полинуклеотидную цепь, остов которой состоит из перемежающихся остатков сахара и фосфата. Как показано на рис. 2.5, атом в 5 -поло-жении одного пентозного кольца соединен с атомом в З -положении следующего пентозного кольца через фосфатную группу. Принято говорить, что сахарофосфатный остов состоит из (5 -3 )-связей. Концевой нуклеотид на одном конце цепи имеет свободную 5 -группу, на другом конце-свободную З -группу. Последовательности нуклеиновых кислот принято писать именно в таком направлении от 5 -конца к З -концу. [c.25]

Значительные методические трудности создаются при определении специфических продуктов гидролиза, образующихся из концевых групп полинуклеотидной цепи, в присутствии большого избытка продуктов, возникающих из центральных звеньев цепи. Это особенно существенно для нуклеиновых кислот с высоким значением молекулярного веса. Существенное повышение чувствительности определения концевых групп достигается введением радиоактивной метки. Для этой цели могут быть использованы химические или ферментативные методы. [c.46]

V. КОНЦЕВЫЕ ГРУППЫ ПОЛИНУКЛЕОТИДНОЙ ЦЕПИ [c.44]

Как видно из схемы, в дезоксирибонуклеиновой кислоте все мономерные звенья, за исключением концевых, не содержат свободных гидроксильных групп в рибонуклеиновых кислотах, напротив, мономерные звенья полинуклеотидной цепи имеют свободную гидроксильную группу при С-2, соседнюю с фосфодиэфирной группировкой. Это различие в структуре определяет глубокое различие в физико-химических свойствах РНК и ДНК. [c.27]

Концевой остаток нуклеозида (или нуклеотида), связанный с полимерной цепью только через гидроксильную группу при С-5, принято называть З -конце-вым остатком полинуклеотидной цепи. Аналогично 5 -концевым остатком называется остаток нуклеозида (или нуклеотида), связанный с цепью полимера только через гидроксильную группу при С-3. При обычном способе написания сокращенных формул полинуклеотидов (для одноцепочечных полимеров) З -кон ценой остаток находится на формуле справа, а 5 -концевой — слева. [c.44]

Известная специфичность ферментов позволяет воссоздать некоторые частичные последовательности полинуклеотидной цепи. Далее проводят расщепление исходного полинуклеотида на более крупные блоки (чаще всего для этой цели применяют частичный гидролиз гуанил-РНК-азой) и отыскивают в них участки нуклеотидных последовательностей, позволяющие однозначно расставить в полинуклеотидной цепи фрагменты, полученные ранее, и воссоздать таким образом полную структуру полинуклеотида. Существенным моментом для успеха такой реконструкции является присутствие в нуклеотидной последовательности уникальных участков, которые могут быть использованы как отправные точки. Для этой цели можно использовать концевые группы, а также редкие компоненты или олигонуклеотиды, встречающиеся в продуктах ферментативного гидролиза полинуклеотида только один раз. [c.73]

При исследовании фосфатных концевых групп, образующихся во время тепловой инактивации РНК ВТМ, Гордон и Хаф [663] пришли к выводу, что разрыв полинуклеотидной цепи не приводит к образованию моноэфирных фосфатных грунн (2, 3 и 5 ). Они полагали, что разрыв цепи при pH 6,8, по-видимому, приводит к образованию концевого 2, З -циклического фосфата. [c.316]

Для осуществления молекулярного клонирования недостаточно одних только ферментов рестрикции. Во-первьгх, водородные связи между теми четырьмя основаниями, которые образуют липкие концы, недостаточно прочны, чтобы удержать два объединившихся фрагмента ДНК. Необходим какой-то инструмент для устранения разрыва в сахарофосфатном остове молекулы, т. е. для восстановления связи между 3 -гидроксильной концевой группой одной цепи и 5 -фосфатной группой другой. Таким инструментом является ДНК-лигаза бактериофага Т4. Этот фермент катализирует образование фосфо-диэфирных связей между концами полинуклеотидных цепей, которые уже удерживаются вместе благодаря спариванию липких концов. Кроме того, ДНК-лигаза Т4 сшивает тупые концы, которые сближаются друг с другом после того, как объединяемые фрагменты связываются с ферментом (рис. 4.6). Во-вторых, объеди- [c.55]

Концевая фосфатная группа полинуклеотидной цепи может быть превращена в фосфоанилид взаимодействием с С-анилином и дициклогексилкарбодиимидом " более общий метод состоит в превращении концевого остатка нуклеотида в двузамещенный пирофосфат 98 при реакции с С-метилфосфоморфолидом. [c.46]

Аналогичные закономерности наблюдаются прн катализированном ферментами синтезе (биосинтезе) полимеров. Мономеры в этом случае являются бифункциональными соединениями, но вследствие высокой специфичности катализатора оказывается возможным взаимодействие лишь одной из функциональных групп мономера с определенным концом растущей полимерной цепи. Например, фермент полинуклеотидфосфорилаза, с помощью которого происходит биосинтез полирибонуклеотидов из нуклеозиддифосфа-тов, катализирует взаимодействие концевой 3 —ОН группы растущей полинуклеотидной цепи с пирофосфатной связью в мономере [c.368]

Как уже упоминалось, ПК в качестве лигандов могут обладать как групповой специфичностью (для белков хроматина, факторов управления трансляцией, нуклеаз и др.), так и индивидуальной (для индивидуальных мРНК, белков-регуляторов транскрипции и др.). Во втором случае на аффинном сорбенте должны быть закреплены вполне определенные участки генома. Это стало возмолшым после создания способов отбора и наработки в достаточных количествах строго идентичных фрагментов ДНК методами генной инженерии. В последнее время возникла еще одна область использования иммобилизованных НК — в качестве праймеров матричного синтеза. Эти приложения предъявляют разные требования к характеру фиксации НК на матрице. В первом случае расположение точек закрепления на молекуле НК может быть произвольным, во втором определенные и достаточно протяженные участки полинуклеотидной цепи должны быть свободны для комплементарного взаимодействия, а в третьем закрепление НК на матрице желательно осуществить лишь по одному определенному концу молекулы. Что же касается возможности реакций с активированными матрицами, то вдоль всей молекулы НК во множестве располагаются химически эквивалентные группы аминогруппы нуклеиновых оснований, гидроксилы сахаров и др. В особом положении находится только концевой остаток фосфорной кислоты или сахара. [c.387]

Нолинуклеотидная цепь молекулы РНК имеет на одном конце почти всегда свободный монофосфорный эфир, который принято обозначать как 5 -конец на противоположном конце цепи такой фосфат отсутствует, а содержится нуклеотид со свободными 2 - и З -гидроксильными группами. Если подвергнуть щелочному гидролизу молекулу РНК, то в качестве концевого нуклеотида будут обнаружены ЦМФ со свободным фосфатом у 5 -конца и свободный аденозин в виде свободного нуклеозида у З -конца полинуклеотидной цепи. [c.106]

Для иллюстрации общих методов выяснения природы концевых групп в полинуклеотидных цепях приведем несколько простых примеров. Используя очищенную фосфодиэстеразу из [c.50]

Добавление некоторого ограниченного числа нуклеотидных единиц к концу молекулы имеющегося полирибонуклеотида не может рассматриваться как полинуклеотидный синтез. Тем не менее эта реакция близка к нему, имеет большое значение и хорошо сейчас изучена. В 1956 г. было показано, что в присутствии фосфорилирующей системы Р -аденозин-5 -мопофосфат целиком включается в РНК в цитоплазме печени крыс [149]. После гидролиза диэстеразой змеиного яда был получен меченый 5 -АМФ, а после щелочного гидролиза — меченые цитидип-2 - и цитидин-З -монофосфаты. Это говорит о том, что в РНК АМФ преимущественно присоединяется к ЦМФ. Подобные наблюдения на различных биологических объектах были проведены многими исследователями. Эти данные наряду с данными о том, что основная часть включенного аденина освобождается после щелочного гидролиза в виде нуклеозида, свидетельствуют о том, что АМФ присоединяется к концу цепи РНК. На важность этих наблюдений впервые обратили внимание Замечник, Хоглэнд и их сотрудники [150—152] в Бостоне, работавшие с растворимой, т. е. транспортной, РНК (s-PHK) цитоплазмы печени крысы. s-PHK отличается от РНК рибосом или микросом своеобразной способностью акцептировать нуклеотиды, присоединяясь к ним своей концевой группой, Такое присоединение нуклеотидов к концу цепи РНК обязательно предшествует прикреплению аминокислот в процессе биосинтеза белка. Все s-PHK из тканей животных, дрожжей и бактерий ведут себя в этом отношении одинаково. [c.251]

Практически, однако, дело обстоит несколько сложнее. Расщепление полинуклеотидов с концевой фосфатной группой гладко протекает лишь при использовании химических методов деградации, при расщеплении же под действием ферментов существенным условием быстрого протекания реакции является отсутствие фосфатной группы на З -конце полинуклеотидной цепи в случае фосфодиэстеразы змеиного яда и на 5 -конце—в случае фосфодиэстеразы селезенки (см. стр. 67). По этой причине перед ферментативным расщеплением необходимо удаление концевых фосфатных групп действием фосфомоноэстеразы, что приводит к исчезновению специфического фрагмента, образующегося из фосфорилированного конца цепи. [c.46]

Химизм реакции образования нуклеиновых кислот. Механизм происходящей при биосинтезе нуклеиновых кислот химической реакции заключается в переносе остатка нуклеозидмоиофосфата от нуклеозидтрифосфата на концевой нуклеотидный остаток растущей в процессе синтеза полинуклеотидной цепи. Перенос идет на место атома Н гидроксильной группы, стоящей при 3-м углеродном атоме рибозы или дезоксирибозы концевого нуклеотида, и сопро- [c.246]

Для рибонуклеиновой кислоты из вируса табачной мозаики данных о наличии концевого 5 -фосфата не получено [151], хотя с некоторыми вирусными препаратами и могут быть ассоциированы короткие полинуклеотидные цепи, несущие на конце 5 -фосфомоно-эфирную группу [152]. [c.390]

Концевые группы — идентифицирующиеся нуклеотиды или их последовательности на концах полинуклеотидных цепей молекул нуклеиновых кислот. Общие методические приемы определения природы концевых групп иллюстрирует такой простой пример. [c.57]

Пользуясь высокими концентрациями очищенной фосфодиэстеразы змеиного яда, можно обнаружить, что продукты гидролиза РНК представлены преимущественно нуклеозид-5 -фосфатами, но среди них обнаруживаются и пиримидиновые нуклеозиддифосфаты. Если левый конец цепи заканчивается пуриновым нуклеотидом, а правый — пиримидиновым, то гидролиз фосфодиэстеразой яда 3 -фосфатных связей приведет к образованию пуринового нуклеозида из левой концевой группы и пиримидинового нуклеознд-3, 5 -дифосфата из правой концевой группы. Таким способом количественно и качественно определяют концевые группы и устанавливают длину полинуклеотидной цепи. Существуют и другие, более сложные методы анализа концевых групп. [c.57]

РНК, концевые группы — нуклеотидные остатки или их последовательности на двух противоположных концах полирибонуклеотидной цепи. Существуют различные приемы определения концевых групп в полинуклеотидных цепях. Например, при использовании высокоочищенных препаратов фосфодиэстеразы змеиного яда в продуктах гидролиза РНК в основном обнаруживаются нуклеозид-5 -ионофосфаты, но наряду с ними содержится также небольшое количество пуриновых нуклеозидов и пиримидиновых нуклеозиддифосфатов. Механизм такого гидролиза схематически изображен на рис. 26. Из этого рисунка следует, что с левого конца цепи отщепляется нуклеозид, с правого —нуклеознд-3, 5 -ди( юсфат. Нуклеозид-5 -фосфаты образуются из внутреннего отрезка полинуклеотидной цепи. [c.78]

Концевые группы после соответствукицего гидролиза можно выделить хроматографически и дать им количественную и качественную оценку, а также определить длину полинуклеотидной цепи. [c.78]

Фосфодиэстераза селезенки — неспецифическая экзонуклеаза, гвдролизующая РНК с образованием нуклеозид-3 -монофосфатов. Гидролиз полинуклеотидных цепей РНК фосфодиэстераза селезенки начинает с 5 -гидроксильного конца цепи. Субстратом для этого фермента могут быть также олигонуклеотиды, возникающие вследствие действия ДНК-азы II на ДНК, в результате которого образуются дезоксирибонуклео-зид-3 -фосфаты. Полинуклеотиды с б -фосфат ной концевой группой фосфодиэстеразой селезенки не гидролизуются. [c.86]

Для иллюстрации химических и ферментативных реакций удобно изображать полинуклеотидную цепь в виде диаграммы, где нуклеозид обозначается вертикальной линией, в верхней части которой ставится символ гетероциклического основания, входящего в этот нуклеозид Фосфодиэфирная связь изображается наклонной линией, прерываемой буквой р, соединяющей среднюю точку (Сз- -положение) с нижним концом (Сб -положение) следующей вертикальной линии справа. Концевая фосфомопоэфирная группа обозначается также буквой р. Тринуклеотиды I и II с помощью диаграмм можно представить так [c.384]

Метод последовательного расщепления вирусной РНК впервые был разработан для РНК ВТМ и успешно использован для идентификации пяти крайних нуклеотидов с правого конца этой молекулы (фиг. 20) [471, 472]. Видно, ничто не мешает усовершенствовать этот метод до такой степени, что будет возможно отщеплять последовательно 10—20 нуклеотидов и идентифицировать их. Сущность метода состоит в окислении концевой гликольной группы (две соседние ОН-группы в т ис-положении) до двух альдегидных групп. Наличие альдегидной группы в положении 3 приводит к ослаблению эфирной связи при -угле-родном атоме (5 ), вследствие чего окисленный концевой нуклеозид отщепляется при комнатной температуре и pH 5 в присутствии анилина в качестве катализатора. Оставшуюся полинуклеотидную цепь, теперь уже с фосфорили-рованным концом, обрабатывают фосфомоноэстеразой, которая специфически отщепляет моноэтерифицированный фосфат. В результате возникает новая гликольная группа, и вышеописанные циклы окисления, -элиминирования и дефосфорилирования можно повторять до тех пор, пока не произойдет случайных разрывов в цепи и не появятся дополнительные ложные концевые группы, которые приведут к искажению результатов. Отщепленные окислен- [c.96]

Устранение суперспирализации молекул ДНК осуществляют свивела-зы, илирелаксирующие белки. Затем при участии ДНК-полимеразы синтезируются новые полинуклеотидные цепи. Фермент катализирует связывание мононуклеозидтрифосфата со свободной концевой группой З -ОН цепи ДНК, и таким образом, синтез происходит в направлении от 5-конца к З -концу полинуклеотидной цепи. Поэтому на одной из цепей репликативной вилки новая цепь синтезируется непрерывно по мере раскручивания ДНК-матрицы. В активном центре всех ДНК и РНК-полимераз [c.350]

Группа Летсингера и Клотца разработала недавно метод синтеза иеитидов с использованием матриц этот метод напоминает природный механизм синтеза на рибосомах (рис. 2.1). В методе используются полимерный носитель и полинуклеотидная матрица, но отсутствует необходимость, как и в природных системах, временно защищать аминокислоты для образования правильных связей. Такой подход назван методом комплементарного носителя (рис. 2.5). Растущая полипептидная цепь связана концевой карбоксильной группой с 5 -ОН-группой олигонуклеотида эфирной связью. Новая поступающая аминокислота также присоединена эфирной связью, но с З -ОН-групной второго олигонуклеотида. [c.65]

Хотя оба метода позволяют получать полинуклеотиды длиной до 100 нуклеотидов и более, с их помощью нельзя получить функциональные гены. Поэтому синтетические олиго- и полинуклеотиды, используемые для сборки гена, и в настоящее время сшивают способом, который на заре развития полинуклеотидно-го синтеза был предложен Г.Корана для соединения 20-мерных олигонуклеотидов, полученных фосфодиэфирным методом (рис. 83). Для соединения олигонуклеотидов I и II используется третий, вспомогательный, нуклеотид III, которых комплементарен 5 -концу одного и 3 -концу другого олигонуклеотида, образуя дуплекс с ником. Этот вспомогательный нуклеотид III играет роль матрицы для олигонуклеотидов I и II, причем его 3 -конец комплементарен 3 -концу олигонуклеотида II, а 5 -конец — 5 -концу олигонуклеотида I, несущего фосфомоноэфирную группу. Размер матрицы должен обеспечивать достаточную устойчивость дуплекса с ником, для чего каждый из сшиваемых олигонуклеотидов должен перекрывать матрицу III длиной по 8—10 пар нуклеотидов. Обработка комплекса олигонуклеотидов I, II и III ДНК-лигазой в присутствии доноров остатков АМР (АТР или NAD ) приводит к сшиванию олигонуклеотидов I и II. Как видно из рис. 83, двуцепочечный фрагмент образуется с выступающими одноцепочечными концами. Эти концы могут быть использованы для дальнейшего наращивания цепи. Для этого необходимо синтезировать олигонуклеотиды IV и V, частично перекрывающие выступающие 3 - и 5 -концевые фрагменты I — II нуклеотида. Обработка комплекса, содержащего олигонуклеотиды I — II, III, IV [c.298]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология