Фракционирование клеточных центрифугирование

Рис. 13-24. Фракционирование клеточного экстракта методом дифференциального центрифугирования. Клеточная мембрана разрушается силами трения в гомогенизаторе с вращаю-ищмся поршнем. После удаления остатков соединительной ткани и обрывков кровеносных сосудов при помоцщ сита нз нержавеющей стали клеточный экстракт центрифугируют несколько раз, постепенно увеличивая скорость вращения ротора.

Одним из главных усовершенствований в деле фракционирования клеточных компонентов было введение техники центрифугирования в градиенте плотности. Различают два типа градиентов непрерывный, создаваемый с помощью специальных устройств различной степени сложности, и прерывистый, образующийся путем осторожного наслаивания друг на друга вручную нескольких слоев с различной плотностью (при этом самый тяжелый слой обычно помещается на дно пробирки). Градиенты плотности используют для двух различных целей. [c.250]

Разработаны методы выделения ядерной ДНК из каллуса, листьев, протопластов и отдельных клеток. В каждой лаборатории используют определенные варианты методик, которые обычно -подразумевают разрушение свежего растительного материала, удаление неразрушенной ткани фильтрованием, фракционирование клеточных компонентов дифференциальным центрифугированием, обработку ядер ДНКазой, лизис, депротеинизацию и последующую очистку нуклеиновых кислот в градиенте плотности s l/БЭ [6, 16]. В данном разделе изложены методики, которые можно взять за основу при разработке способов выделения ядерной ДНК из различного растительного материала. Кроме того, ядра, выделенные, как указано ниже, могут исполь- [c.254]

Распределение ферментов по субклеточным орга-неллам изучают после предварительного фракционирования клеточных гомогенатов путем высокоскоростного центрифугирования, определяя содержание ферментов в каждой фракции (см. гл. 2). [c.71]

Л. 6 выделяют из микросом путем центрифугирования клеточного гомогената при ускорении 105 000 g с послед, осаждением белков сульфатом аммония. Индивидуальные белки получают фракционированием с помощью хроматографии (в т. ч на гелях агарозы, содержащих ковалентно иммобилизованные фосфолипиды, и гель-фильтрацией на сефадексе), а также изоэлектрич. фокусированием в градиенте pH. Активность Л. б. определяют по перераспределению метки (изотопной, спиновой или флуоресцентной см. Липидные зонды) между донорными мембранами, содержащими меченые липиды, и немечеными акцепторными мембранами. [c.598]

Рибосомы вьщеляют путем дифференциального центрифугирования клеточного содержимого, получаемого после гомогенизации клеток. Известно, что этим путем удается разделить клеточное содержимое на ряд фракций (см. гл. I). Рибосомы связаны главным образом с мембранами эндоплазматической сети. Поэтому при фракционировании содержимого клетки они осаждаются вместе с обломками липопротеиновой мембраны—микросомами. [c.285]

Такой способ фракционирования можно сочетать с выделением пробы. Например, при исследовании липидных фракций одноклеточных организмов первой стадией является деструкция клетки, обычно выполняемая под давлением или с помощью ультразвука. В любом случае разрушаемые клетки помещают в метанольный или водный раствор. Раствор сильно подщелачивают (10%-ный раствор гидроксида натрия) и оставляют на ночь. На этой стадии большинство эфирных связей (триглицериды) гидролизуются, а свободные кислоты, конечно, полностью нейтрализуются сильным основанием. Экстракция таким неполярным растворителем, как -гептан, приводит к удалению только так называемых не омыляемых липидов (стеринов), не затрагивая заметную часть основы клеточного вещества. Большие массы остатков органического вещества клетки могут создавать затруднения при экстракции, особенно после гидролиза. Поэтому перед экстракцией удобно проводить чисто механическое разделение — удалять остатки органических веществ центрифугированием. Фракция, содержащая жирные кислоты, может быть получена подкислением водной фазы с последующей второй экстракцией гептаном. [c.516]

Хотя доступные в настоящее время препараты ДНК бактерий, животных и растений, несомненно, представляют собой многокомпонентные смеси, эффективного их фракционирования с помощью существующих методов добиться не удается. В отдельных случаях, однако, удается получить данные, указывающие на присутствие в суммарном препарате ДНК полинуклеотидов, отличающихся по своим свойствам от основной массы ДНК клеточного ядра и являющихся, таким образом, особыми разновидностями ДНК. Так, из препаратов ДНК бактерий при фракционировании с помощью противоточного распределения, центрифугирования в градиенте сахарозы, хроматографии на фосфате кальция или колонках с МАК получены фракции, свойства которых соответствуют свойствам одноцепочечной ДНК (см., например, предполагается, что такая ДНК является промежуточным продуктом при воспроизведении ДНК в клетке. [c.34]

Для получения гранул в виде осадка, который можно подвергнуть анализу, производят фракционированное центрифугирование этих экстрактов, прибавив к ним предварительно раствор солей или сахарозы соответствующей концентрации и удельного веса. В результате непродолжительного центрифугирования при небольших скоростях из экстрактов удаляются оставшиеся целыми клетки, клеточные ядра и большие гранулы, называемые митохондриями. Дальнейшее центрифугирование при больших скоростях приводит к осаждению субмикроскопических гранул, называемых микросомами [97—100]. Для разделения цитоплазматических гранул можно применить также хроматографию [101]. [c.396]

После того как зараженная клеточная культура подвергается дифференциальному центрифугированию или какой-либо другой процедуре фракционирования, необходимо идентифицировать фракции, содержащие нужный материал. При необходимости можно использовать методы, описанные в разд. 4.1 и 4.2, но они требуют довольно много времени альтернативные подходы состоят в том, что во фракциях градиента по поглощению в ультрафиолете идентифицируют пики РНК или белка. или же в материал, подвергаемый очистке, включают в качестве маркера радиоактивно меченный вирус. Затем в аликвотах из каждой фракции любым стандартным методом (например, с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика) можно определить радиоактивность. Если есть возможность получить радиоактивно меченный материал, данный метод очень удобен, поскольку он занимает мало времени, точен и прост в исполнении. [c.57]

Фракционирование клеток в солевом растворе осложняется тенденцией гранул образовывать скопления и осаждаться в виде комков, а не в виде отдельных частиц. Это нежелательное явление можно предотвратить, измельчая клетки в 0,88 М растворе сахарозы, в котором митохондрии сохраняют палочковидное строение и способность к суправитальному окрашиванию янусом зеленым В. Однако при указанной концентрации сахарозы среда становится настолько вязкой и плотной, что для осаяедения субклеточных фракций приходится использовать чрезвычайно высокие скорости центрифугирования. Поэтому в современных исследованиях в качестве среды для измельчения клеток используют 0,25 М раствор сахарозы, в котором не происходит агрегации гранул и легко выделяется фракция митохондрий. Последние при этом обладают теми я е биохимическими свойствами, что и митохондрии, получаемые в 0,88 М растворе сахарозы, хотя они уяге не окрашиваются янусом зеленым В и имеют скорее шаровидную, а не удлиненную форму. При разделении путем дифференциального центрифугирования субклеточных фракций из гомогената в 0,25 М растворе сахарозы, полученного в гомогенизаторе Поттера — Эльвейема, удаление ядер и клеточных обломков, включая [c.130]

Фракционирование гомогенатов. Из гомогената можно выделить субклеточные частицы, как надмолекулярные (клеточные органеллы), так и отдельные соединения (ферменты и другие белки, нуклеиновые кислоты, метаболиты) (см. рис. 6.8). Например, с помощью дифференциального центрифугирования можно получить фракции ядер, митохондрий, микросом (микросомы — это фрагменты эндоплазматического ретикулума). Эти органеллы различаются размерами и плотностью и поэтому осаждаются при разных скоростях центрифугирования. После осаждения микросом в надосадочной жидкости остаются растворимые компоненты клетки — растворимые белки, метаболиты. Каждую из этих фракций можно разными методами фракционировать дальше, выделяя составляющие их компоненты. Из выделенных компонентов можно реконструировать биохимические [c.195]

Аналитическое и препаративное фракционирование клеток рассмотрено в двух главах, посвященных проточной цитометрии н элютриационному центрифугированию. Методы анализа на клеточном и субклеточном уровнях приведены в главе, посвященной гибридизации in situ. В главе, посвященной органной культуре, подчеркнуто значение клеточных взаимодействий и сохранения гистологической структуры ткани и приведены стандартные методы ведения органной культуры. Наконец, в главе, посвященной определению жизнеспособности клеток и оценке цитотоксичности, рассматриваются проблемы токсикологии и скрининга противоопухолевых препаратов, а также стандартные методы оценки выживаемости клеток в культуре. [c.7]

Процессы, характерные для целой клетки, протекают в отдельных клеточных частицах и органеллах, которые для анализа выделяют из клетки с помощью фракционирования. Этот процесс обычно состоит из двух этапов (разд. 1.10.3) сначала клетки разрушают, а затем из образовавшейся суспензии методом центрифугирования (гл. 2) выделяют нужные частицы и органеллы. Дальнейшее разделение индивидуальных компонентов клеточных частиц и органелл и изучение их свойств проводят с помощью центрифугирования (гл. 2), хроматографии (гл. 3) или электрофореза (гл. 4). Для. определения состава, механизма действия и функций клеточных компонентов пользуются сложными количественными и качественными аналитическими методами. На атомном и молекулярном уровнях применяют целый ряд спектральных методов (гл. 5) механизм действия клеточных частиц и внутриклеточные взаимодействия изучают, используя одновременно несколько аналитических методов, таких, как спектроскопия (гл. 5) и радиоизотопные методы (гл. 6), потенциометрия, полярография (гл. 7) и манометрия (гл. 8). [c.18]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология