Клеточные компоненты, фракционирование

МЕТОДЫ ФРАКЦИОНИРОВАНИЯ КЛЕТОЧНЫХ КОМПОНЕНТОВ [c.249]

Одним из главных усовершенствований в деле фракционирования клеточных компонентов было введение техники центрифугирования в градиенте плотности. Различают два типа градиентов непрерывный, создаваемый с помощью специальных устройств различной степени сложности, и прерывистый, образующийся путем осторожного наслаивания друг на друга вручную нескольких слоев с различной плотностью (при этом самый тяжелый слой обычно помещается на дно пробирки). Градиенты плотности используют для двух различных целей. [c.250]

Изучение клеточной организации и попытки установить связь между структурой и функцией на различных иерархических уровнях — от простых молекул до макромолекул и таких агрегатов, как мембраны или частицы, до субклеточных единиц и, наконец, клеток — все это составляет одну из самых увлекательных и перспективных областей исследования в современной биологии. Для биохимика и цитолога выяснение химического значения различных сложных структурных элементов, обнаруженных в клетке, важно не только само по себе оно является необходимой ступенью любого исследования, направленного на то, чтобы понять, как происходит синтез, распад и взаимодействие этих элементов. Мы начинаем догадываться, что именно в этих сложных структурах скрыт секрет механизмов, с помощью которых осуществляется регуляция клеточных процессов как в пространстве, так и во времени. Этот секрет, возможно, заключается, по крайней мере отчасти, в том, что различные клеточные компоненты — главным образом ферменты, а также их субстраты и модификаторы (активаторы и ингибиторы) — находятся в разных отсеках клетки и потому не всегда доступны друг для друга. Из сказанного вытекает два вывода, подтвержденных в последнее время многочисленными экспериментальными данными 1) в клетке существует четкое распределение некоторых ключевых компонентов, особенно ферментов они локализуются в (или на) определенных клеточных структурах, представляющих собой микроскопические внутриклеточные органы, так называемых органеллах 2) эти структуры, а вместе с ними и соответствующие клеточные компоненты можно выделить с помощью подходящих мягких методов разрушения клеток (гомогенизация) и последующего фракционирования. [c.239]

Ниже мы очень кратко рассмотрим данные по анатомии клетки, полученные с помощью электронного микроскопа, и опишем соответствующие клеточные структуры затем мы обсудим методику фракционирования клеточных компонентов и некоторые свойства получаемых фракций и, наконец, попытаемся как-то оценить эти данные с точки зрения биохимии и энзимологии. [c.239]

Биохимический анализ часто сопряжен с разрущением тонкой структуры клеток. Однако в настоящее время разработаны методы мягкого фракционирования клеточного содержимого, целью которых является сохранение функции различных клеточных компонентов. Подобно тому как ткань можно разделить на составляющие клетки различных типов, клетки можно разделить на ее функциональные органеллы и макромолекулы. В этом разделе мы сосредоточим внимание на методах, позволяющих проводить очистку органелл и белков Родственные методы мечения макромолекул радиоизотопами и антителами, равно как и чрезвычайно эффективные методы анализа ДНК и функции генов, обсуждаются в последующих разделах. [c.208]

При данной скорости вращения ротора время, требующееся для осаждения в центрифуге популяции гомогенных частиц, обратно пропорционально квадрату их радиусов и первой степени разности между плотностями частиц и среды и прямо пропорционально вязкости среды. Таким образом, относительно гомогенные, приблизительно сферические частицы с примерно одинаковой плотностью могут быть отнесены к разным классам на основании одних только различий во времени, необходимом для их осаждения. Именно на этом и основана классическая схема фракционирования клеточных компонентов. Вначале удаляют целые клетки и крупные обломки клеток затем — фракцию, содержащую крупные и плотные ядра (плотность ДНК при 4° равна а плотность большинства белков — только 1,188) [c.249]

Последовательность событий, приводящих к фиксации азота, во многом еще не ясна. Важнейшим шагом вперед на пути познания механизма фиксации азота явилась разработка метода получения азотфиксирующих бесклеточных препаратов из различных организмов. Благодаря этому стали возможными фракционирование, очистка и в конечном счете идентификация тех клеточных компонентов, которые участвуют в фиксации азота. [c.421]

Рис. 5.9. Фракционирование клеточных компонентов с помощью центрифуги. Развиваемые центрифугой центробежные ускорения измеряются числом g(g — ускорение силы тяжести).

Разработаны методы выделения ядерной ДНК из каллуса, листьев, протопластов и отдельных клеток. В каждой лаборатории используют определенные варианты методик, которые обычно -подразумевают разрушение свежего растительного материала, удаление неразрушенной ткани фильтрованием, фракционирование клеточных компонентов дифференциальным центрифугированием, обработку ядер ДНКазой, лизис, депротеинизацию и последующую очистку нуклеиновых кислот в градиенте плотности s l/БЭ [6, 16]. В данном разделе изложены методики, которые можно взять за основу при разработке способов выделения ядерной ДНК из различного растительного материала. Кроме того, ядра, выделенные, как указано ниже, могут исполь- [c.254]

Всякому структурному исследованию ДНК или РНК предшествуют выделение их из клеток, очистка и фракционирование. Поскольку в клетке нуклеиновые кислоты практически всегда находятся в комплексес белками (т. е. в вил, нуклеопротеидов), их выделение сводится в основном к очистке от белков (депротеинизации). Чаще всего нуклеиновые кислоты экстрагируют из гомогенатов клеток или очищенных клеточных органелл смесью фенол — вода В присутствии ионных детергентов (например, додецилсульфата натрия). При этом белки (и ряд других клеточных компонентов) переходят в органическую фазу, а нуклеиновая кислота остается в водной фазе. Из водного раствора ДНК или РНК осаждают спиртом. [c.10]

Комплемент представляет собой комплекс нескольких белков, обладающих специфической способностью вызывать лизис клеточных антигенов в присутствии соответствующих антител. Было показано, что комплемент состоит, по крайней мере, из четырех компонентов средней части, концевой части, третьего компонента и четвертого компонента. Для этих компонентов предложены следующие сокращенные обозначения С 1, С 2, С З и С 4. Указанные компоненты можно отделить друг от друга при помощи фракционирования сернокислым аммонием [126]. [c.348]

Природу клеточной оболочки определяют путем разрушения клеток и фракционирования клеточных структур, благодаря чему появляется возможность ясно различить упорядоченную тонкую структуру слоев клеточной стенки. Этот прием позволяет разделить и сделать видимыми такие компоненты, как мембраны, мезосомы, другие цитоплазматические мембранные системы, газовые вакуоли, метаболические гранулы, рибосомы, жгутики, ворсинки и т. д. (Гидродинамические силы, возникающие при отборе раствора шприцем или при чрезмерно интенсивном пропускании его через пипетку, могут привести к отрыву жгутиков и ворсинок от клеточной поверхности.) Краситель проникает в периплазма-тическое пространство между мембраной и клеточной стенкой, и, благодаря тому что он заполняет все образуемые мембраной углубления, выявляются очертания мезосом. Это в свою очередь позволяет быстро (и обычно точно) определить, какую бактерию изучают —грам-отрицательную или грамположительную. [c.107]

При изучении рибосом и других компонентов клетки применяются разнообразные биохимические методы. Один из самых главных основан на фракционировании клеток. Основные этапы этой процедуры показаны на рис. 4.6. По своей идее она очень проста клетки размалываются и превращаются в суспензию в определенной среде, образуя нечто вроде супа, который затем переливают в пробирку и центрифугируют с возрастающей скоростью. Разные клеточные элементы образуют осадок, который затем подвергают биохимическому анализу. В нервных клетках [c.86]

Фракционирование гомогенатов. Из гомогената можно выделить субклеточные частицы, как надмолекулярные (клеточные органеллы), так и отдельные соединения (ферменты и другие белки, нуклеиновые кислоты, метаболиты) (см. рис. 6.8). Например, с помощью дифференциального центрифугирования можно получить фракции ядер, митохондрий, микросом (микросомы — это фрагменты эндоплазматического ретикулума). Эти органеллы различаются размерами и плотностью и поэтому осаждаются при разных скоростях центрифугирования. После осаждения микросом в надосадочной жидкости остаются растворимые компоненты клетки — растворимые белки, метаболиты. Каждую из этих фракций можно разными методами фракционировать дальше, выделяя составляющие их компоненты. Из выделенных компонентов можно реконструировать биохимические [c.195]

Значительная часть всех клеточных компонентов, включая многие ферменты, питательные вещества и макромолекулярные проду1 ты, находится, по-видимому, в свободном состоянии в цитоплазме или клеточном соке. Это видимое отсутствие структуры, возможно, является лиц(ь иллюзией, возникающей в силу нашей неспособности рассмотреть и исследовать организацию этих комионентов in situ или после разрушения клеток и фракционирования клеточного содержимого. [c.248]

При разделении субклеточных компонентов мы сталкиваемся с двумя основными затруднениями. Первое из них связано с возможностью возникновения артефактов. В процессе разделения могут образоваться структуры, которых не было в исходной клетке. К артефактам относится, например, расщепление индивидуальных клеточных компонентов на субъединицы, утрата биологической активности субклеточными компонентами (в результате ферментативной шш иной деградации) в процессе выделения, неспецифическое связывание белков с нуклеиновыми кислотами и т. д. Хотя нет единого и притом надежного способа избежать артефактов, но в общеммы можем сказать, что при соблюдении определенных условий вероятность появления артефактов можно свести к минимуму. Условия эти следующие быстрота проведения всех операций по фракционированию, работа на холоду, применение наиболее мягких спо- [c.11]

Для многих исследований можно подобрать такой предшественник, который будет весьма специфичным ддя определенного класса макромолекул (например, лейцин для белка). В таких случаях меченые молекулы можно определить по их радиоактивности в присутствии других немеченых веществ. Однако для изучения различных вопросов метаболизма желательно использовать неспецифический предшественник, который будет включаться в пуклеиновые кислоты, белки и другие клеточные компоненты и метить их. В этом случае необходимо отделять и очищать каждый класс изучаемых молекул. Обзор методов химического фракционирования различных биополимеров приведен в ряде работ [2, 3]. Первая попытка использовать фильтры для улучшения фракционирования была сделана при разделении радиоактивности разных биополимеров после включения в них 1-С -глицина. Однако в этом случае полученные фракции нуклеиновых кислот были загрязнены пептидами, которые требовалось удалять [4]. [c.138]

Однако существенные сдвиги в изучении биологии нуклеиновых кислот произошли лишь в 40-х годах. Использование новых методов цитохимии и фракционирования клеточного содержимога позволило установить, что ДНК и РНК являются нормальными компонентами всех клеток — как растительных, так и животных, причем ДНК локализована в ядре, а РНК встречается и в цитоплазме [10, 11, 12, 13, 14, 18]. Более того, подобного рода исследования доказали, что в интерфазе и при митозе в ядре ДНК сосредоточена, по-видимому, в хромосомах. Последнее наблюдение- [c.12]

Процессы, характерные для целой клетки, протекают в отдельных клеточных частицах и органеллах, которые для анализа выделяют из клетки с помощью фракционирования. Этот процесс обычно состоит из двух этапов (разд. 1.10.3) сначала клетки разрушают, а затем из образовавшейся суспензии методом центрифугирования (гл. 2) выделяют нужные частицы и органеллы. Дальнейшее разделение индивидуальных компонентов клеточных частиц и органелл и изучение их свойств проводят с помощью центрифугирования (гл. 2), хроматографии (гл. 3) или электрофореза (гл. 4). Для. определения состава, механизма действия и функций клеточных компонентов пользуются сложными количественными и качественными аналитическими методами. На атомном и молекулярном уровнях применяют целый ряд спектральных методов (гл. 5) механизм действия клеточных частиц и внутриклеточные взаимодействия изучают, используя одновременно несколько аналитических методов, таких, как спектроскопия (гл. 5) и радиоизотопные методы (гл. 6), потенциометрия, полярография (гл. 7) и манометрия (гл. 8). [c.18]

Методы, собранные в этих двух книгах, весьма разнообразны и охватывают почти все стороны исследований этой важнейшей грунны соединений. Здесь можно найти методы выделения и анализа отдельных компонентов нуклеиновых кислот (пуриновых и пиримидиновых оснований, нуклеозидов и нуклеотидов), методы выделения, разделения и анализа олигонуклеотидов, изолирования отдельных клеточных органелл, выделения и фракционирования нуклеиновых кислот (ДНК и РНК), а также изолирования их суммарной фракции для различного рода исследований, способы идентификации нуклеиновых кислот, методу. модификации их молекул, методы изучения их синтеза как in vivo, так и in vitro, методы изучения нуклеиновых кислот в связи с процессом биосинтеза белка и, наконец, методы изучения биологических свойств нуклеи1говых кислот, в том числе их иммунологических свойств. [c.5]

Ранее обсуждался пример многократной очистки рестриктазы E oR I после проведения стадии удаления нуклеиновых кислот при помощи ПЭИ [48, 263]. Скорее всего такая эффективность данной стадии в отношении очистки целевого фермента является исключением. Учитывая то, что фракционированию подвергается сложная смесь клеточных компонентов, содержащихся в грубых экстрактах, а используемые методы не являются избирательными, следует предположить, что в большинстве случаев достигается только эффективное удаление нуклеиновых кислот без сколько-нибудь значительной очистки рестриктаз. Поэтому те немногочисленные примеры работ, в которых приведены количественные данные относительно степени очистки рестриктаз обсуждаемыми способами [13, 127], не противоречащие выше указанному предположению, думается являются типичными. [c.148]

Мереуэзер [55], анализируя 156 литературных источников, опубликованных с 1866 по 1956 г., пытался систематизировать материал в зависимости от применяемых различных воздействий на лигнифицированную клеточную стенку, вызывающих фракционирование химических компонентов и выделение ЛУК. Важным доказательством за илп против химической связи между лигнином и остальными компонентами, ио его мнению, является, в первую очередь, ответ на вопрос можно ли отделить компоненты друг от друга физическими методами, такими, как растворение, ие вызывающими химических изменений Рассмотренные [55] работы Брауна, Грона, Беркмана, Харриса, Чудакова и других показали, что из древесины без химических изменений компонентов можно выделить лишь незначительную часть лигнина. [c.163]

Основные научные работы — в области биохимии нуклеиновых кислот. До 1964 занимался синтезом физиологически активных гетероциклических соединений пиримидинового ряда. Разработал твердофазный метод химического фракционирования транспортных рибонуклеиновых кислот на полиакрил-гидразидных сорбентах. Создал комплекс методов ультрамикро-биохимического анализа, позволяющий проводить исследование нуклеиновых кислот, белков и ферментов в масштабе отдельной клетки. Занимался изучением транспорта нуклеиновых кислот на модели гигантской одноклеточной водоросли — ацетобулярии и показал, что транспорт кислот не коррелирует с полярным ростом клетки (1973—1974), Осуществил сборку жизнеспособной клетки из отдельных компонентов — цитоплазмы, ядра и клеточной стенки, С 1974 занимается синтезом химических эквивалентов структурных генов белков и их встройкой а [c.613]

Не вызывает сомнений высокая эффективность полиэтилен-иминового метода в отношении высаждения нуклеиновых кислот. Однако, отмечены случаи, когда проведение такой процедуры не гарантирует последующей сорбции бесклеточног экстракта на ионитах из-за присутствия в них каких-то не-идентифицированных интерферирующих этому процессу клеточных растворимых компонентов [43]. Выходом из создавшейся ситуации оказалось использование вместо ПЭИ стрептомицин-сульфата или хроматографическое фракционирование грубых экстрактов на ДЭАЭц [43]. [c.147]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология