Белок белки миграция, скорость

Принцип метода. Иммуноэлектрофорез представляет собой комбинацию электрофоретического разделения белков с двойной диффузией и иммунопреципитацией в геле. Вслед за электрофоретическим разделением белков в агаровом геле навстречу полученным фракциям диффундирует специфическая иммунная сыворотка. Этот метод позволяет характеризовать белки не только по скорости миграции в электрическом поле, но и по антигенным свойствам. [c.137]

Фракционирование путем электрофореза представляет собой суммарный результат действия многих факторов, некоторые из которых противоположны друг другу. При электроэндоосмосе присутствие фиксированных зарядов на мембранной или гелевой матрице может вызывать результирующий поток воды в направлении, противоположном направлению миграции белков. В зависимости от изоэлектрической точки данного белка и состава буферного раствора белок может быть нейтральным, чисто катионным или чисто анионным. Суммарный заряд белка будет определять скорость и направление его передвижения. Вследствие того, что электрофорез дает возможность разделять материалы биологического происхождения, представляющие интерес для биоинженерных исследований, можно прогнозировать, что эта область применения электрофореза будет развиваться самостоятельно, наряду с широким использованием указанного метода и для аналитических целей. [c.89]

Выбор знака верхнего электрода связан с тем, что белковый препарат вносят на гель сверху. При этом следует учесть как соображения устойчивости белка при кислых или щелочных значениях pH амфолитов, располагающихся по концам градиента, так и желательность максимального начального заряда белка для увеличения скорости его миграции в геле. Степень устойчивости белка к экстремальным значениям pH может диктовать и момент внесения препарата. Если белок вносят после предварительного фокусирования амфолитов, то он быстрее достигнет своего равновесного положения. Это может иметь первостепенное значение для сохранения биологической активности, если только миграция через область pH конца градиента не представляет для данного белка опасности. В противном случае белковый препарат приходится наносить на гель до начала ИЭФ, когда смесь амфолитов еще имеет среднее значение pH. [c.40]

Для однозначного определения молекулярной массы белка по скорости его миграции при электрофорезе бывает целесообразно распрямить полипептидную цепочку белка и придать ей жесткость. Именно такой прием используется при электрофорезе белков, обработанных додецилсульфатом натрия (подробно это будет рассмотрено ниже). [c.38]

На эту операцию следует обратить особое внимание. Сопоставлять молекулярные массы белков по скорости их миграции можно только в том случае, когда есть уверенность в полной денатурации белка при обработке его ДДС-Na. [c.62]

В результате адсорбции белков, которые при каждом вводе пробы достигают капилляра, силанольные группы на стенках капилляра, ответственные за ЭОП, все более и более блокируются. По этой причине ЭОП замедляется, и ионы движутся к детектору медленнее. Уменьшение скорости движения напрямую отражается на площади пиков. С увеличением времени миграции ионы медленнее проходят через детектор, из-за чего площадь пиков растет. Этим объясняется ход кривых зависимости площади пика от времени миграции, приведенных на рис.54. [c.63]

Метод зонального электрофореза имеет и некоторые недостатки. С его помощью нельзя произвести прямого определения скорости миграции белков. Между исследуемыми белками и поддерживающей средой возможны нежелательные взаимодействия, в результате которых часть белка адсорбируется в среде. Адсорбция происходит сильнее всего на бумаге, менее выражена на ацетат-целлю-лозной мембране и практически ничтожна в агаровом геле. [c.12]

За процессом электрофоретического разделения сывороточных белков легко следить, окрасив сыворотку крови конго красным. Краситель связывается с альбумином и мигрирует вместе с ним. Следует отметить, что в результате окрашивания скорость миграции альбумина несколько увеличивается. [c.143]

В последнее время для установления чистоты белка приобрел большое значение электрофорез. Давно известно (Харди, 1899 г.), что белки мигрируют к аноду в щелочном растворе и к катоду в кислом растворе. Скорость, с которой происходит миграция белка, зависит от соотношения положительных и отрицательных зарядов в макромолекуле, а также и от формы последней следовательно, скорость миграции при определенном pH является характерной константой каждого белка. По методу А. Тизелиуса (1937 г.) раствор белка вводят в нижнюю часть и-образ- [c.417]

На стадии расфокусирования зоны переходят из концентрирующего геля в разделяющий. В разделяющем геле компоненты подвергаются просеиванию , и, следовательно, их подвижность уменьшается из-за более высокой концентрации акриламида. Это резко нарушает стационарные условия, которые определяют существование стопки зон при изотахофорезе. Разделяющий гель готовят в разделяющем буферном растворе (фаза гамма), который содержит компонент 3 и противоион 6, pH разделяющего геля должен отличаться от pH фазы бета (при миграции к аноду быть более высоким). По мере того как фаза бета мигрирует в разделяющий гель, создается новая фаза — ламбда. По мере перемещения движущейся границы (ламбда/гамма) компонент 1 фазы дзета вступает в разделяющий гель, его подвижность становится больше подвижности белков, и компонент 1 начинает двигаться впереди них. Таким образом, появляется новая фаза пи и новая движущаяся граница (пи/ламбда), через которую проходят все зоны белков. Они разделяются в соответствии с их индивидуальными скоростями, определяемыми величиной pH фазы пи, проводимостью и величиной приложенного напряжения. Высокому разрешению при таком разделении белков способствуют несколько факторов а) узкая стартовая зо- [c.122]

Хроматографическое разделение аминокислот на листах фильтровальной бумаги [78] и на колонках с картофельным крахмалом [2] происходит главным образом благодаря различиям в их распределительных и адсорбционных характеристиках. Эти различия вызывают вариации в распределении аминокислот между стационарной и подвижной фазами, что в свою очередь приводит к разным скоростям миграции вдоль хроматограммы. Применение для хроматографии аминокислот синтетических ионообменных смол расширило возможности разделения за счет использования их ионообменных свойств в дополнение к распределительным и адсорбционным эффектам. Все аминокислоты, найденные в белках, проявляют амфотерные свойства прежде всего за счет карбоксила и аминогруппы, присоединенных к а-углеродному атому. Присутствие дополнительных кислотных или основных групп в боковой цепи аминокислоты значительно меняет ионизационные характеристики и общий заряд молекулы нри данном pH. В результате изменения pH раствора, используемого для проявления хроматограммы, происходят характерные изменения суммарного заряда всех аминокислот. Это можно использовать в качестве эффективного и чувствительного способа контроля их относительных скоростей миграции. [c.136]

А. Различия в скоростях миграции вирусных белков [c.114]

Между тем pH в области первоначальной зоны сорбции препарата будет продолжать снижаться. Через некоторое время наступит очередь следующего белка начинать миграцию вниз по колонке. Это будет белок, у которого значение р1 меньше, чем у первого, но наибольшее среди всех остальных. За ним в порядке убывания р1 из стартовой зоны будут выходить один за другим и все остальные белки. Можно сказать, что в верхней части колонки будет идти элюция белков смеси локальным градиентол pH. Каждая белковая зона будет мигрировать со своей скоростью и тем медленнее, чем меньпш значение р1 соответствующего белка (тем легче он сорбируется и труднее десорбируется на всех последующих участках своего пути). К моменту выхода из колонки все белки окажутся разделенными и будут элюироваться в порядке убывания своих р1. [c.331]

Таким образом обратная рекомбинация лиганда и молекул гемовых белков после фотодиссоциации определяется двумя энергетическими барьерами (рис. XI.20, 5). Внутренний барьер — это барьер связывания с гемовым железом. Пиже температуры 160 К процесс рекомбинации описывается темперутурно-независимым распределением энергий активации по подсостояниям. Константа скорости не зависит от вязкости растворителя. Выше 160 К пик распределения энергий активации сдвигается на 10 кДж/моль в сторону более высоких значений. Это вызвано конформационной релаксацией белка в основном состоянии. При Т 300 К быстрые равновесные флуктуации приводят к усреднению констант скоростей рекомбинации. Выше 210 К лиганд покидает молекулу белка и выходит в растворитель, что обусловлено миграцией лиганда через флуктуируюш ий белковый матрикс. Константа скорости на этом этапе сильно зависит от вязкости растворителя. Таким образом, весь процесс рекомбинации включает переходы между конформационными подсостояниями различных уровней. Флуктуации между конформационными подсостояниями полностью расторможенного белкового матрикса позволяют лиганду проникать через него, а флуктуации другого типа ответственны за релаксацию констант и скорости внутрибелковой рекомбинации и железа гема. [c.333]

Поддерживающей средой для электрофореза могут служить фильтровальная бумага, крахмальный или агаровый гели, аце-тат-целлюлозная мембрана, полиакриламидный гель и т. д. Создаваемое в смоченной буферным раствором поддерживающей среде электрическое поле заставляет различные компоненты смеси белков двигаться в определенном направлении со скоростью, соответствующей заряду молекул, что приводит к их разделению. Если электрофорез происходит в крахмальном или полиакриламидном геле, то разделение зависит не только от заряда, но и от величины и формы молекул, так как в этом случае поддерживающая среда выполняет роль молекулярного сита. При электрофорезе в щелочном буферном растворе белки сыворотки крови разделяются по меньшей мере на 5 фракций. При ионной силе 0,1 и pH 8—9 быстрее всех к аноду движется альбумин. За ним следуют в порядке уменьшения скорости миграции а-1-, а-2-, р- и 7-глобулиновые фракции. Подбирая соответствующую поддерживающую среду и буферный раствор, можно улучшить разделение. Поэтому даже в сравнительно малооснащенной больничной или клинической лаборатории зональный электрофорез позволяет проанализировать белки более детально, чем свободный. [c.10]

Начнем элюцию кислым полибуфером. Через некоторое время в верхней части колонки pH начнет изменяться в сторону закисления. Когда он уменьшится до значения р1 наиболее щелочного пз белков, этот белок начнет диссоциировать от обменника, вымываться током буфера и перемещаться вместе с ним по колонке. Но здесь он попадет в область, где снижение pH еще не началось или если и началось, то не достигло значения, равного его р1. Белок снова приобретет отрицательный заряд и свяжется с обменником. В ходе дальнейшей элюции pH понизится и в этой области. Рассматриваемый белок снова десорбируется и переместится еще ниже, где опять сорбируется. Так начинается миграция зоны первого из белков вниз по колонке. Скорость миграции будет определяться скоростью распространения изменения pH по высоте колонки. Она будет заведомо меньше, чем скорость элюции, и тем меньше, чем менее концентрированный полибуфер используется для элюции. [c.331]

Заряженные частицы перемещаются в растворе под влиянием электрического поля с различной скоростью. Уже в первой половине нашего столетия для этого явления было введено понятие "электрофорез" или "электрический перенос". Различие скоростей перемещения может быть обусловлено двумя причинами (а) различные молекулы несут на себе различные заряды и поэтому при наложении электрического поля могут ускоряться в различной степени (б) их перемещению препятствует различающееся по величине сопротивление трения. В простейшем случае разделительная среда (раствор электролита) находится в трубке. Из-за отвода Джоулева тепла на практике зачастую наблюдается искажение зон за счет различных плотностей электролита и конвекционных потоков. В случае классического электрофореза применяются гели или полоски бумаги, пропитанные электролитами для того, чтобы уменьшить помехи, вызванные конвекцией, а также чтобы увеличить сопротивление трения макро-молекул с незначительными различиями в зарядах и тем самым усилить эффект разделения. Использование полиакриламидного гель-электрофореза (ПААГ-электрофореза) позволяет проводить эффективное разделение молекул ДНК и белков. Благодаря изменению степени сшивания геля может быть оптимизирована производительность разделения. При использовании гель-электрофореза белков, денатурированных додецилсульфатом натрия (ДДСН), возможно непосредственное определение их молекулярной массы. Разделение в этом случае основано исключительно на затруднении миграции пробы через гель (без геля все денатурированные додецилсульфатом натрия белки перемещаются с одинаковой скоростью). [c.5]

Для крупных частиц с радиусом большим, чем размер двойного электрического слоя, подвижность частиц близкого состава не зависит от их размеров, что затрудняет разделение больших молекул при электрофорезе, поскольку скорость перемещения молекул ДНК и белков, денатурированных ДДСН, в чистом растворителе идентична. Разделение достигается лишь тогда, когда миграция обусловлена молекулярно-ситовым эффектом (например, в гелях). [c.9]

При так называемом свободном электрофорезе (электрофорезе с подвижной Границей), разработанном Тизелиусом, скорость и направление миграции разных белковых компонентов под влиянием электрического поля в 1]-образном сосуде, содержащем буферный раствор, целиком обусловлены зарядом их молекул. Скорость миграции частицы в электрическом поле определяется как расстояние, пройденное ею в единицу времени на единицу градиента напряжения. Следовательно, каждый из компонентов смеси белков можно выделить и охаратеризовать его скорость миграции. [c.9]

Изотахофорез — метод разделения белков на ряд последовательных зон в соответствии с их электрофоретической подвижностью [58, 61, 62, 65]. Под действием постоянного тока зоны белков располагаются непосредственно друг за другом, как бы складываются в стопку . В присутствии противоионов такие стопки из зон белка, имеющих различные значения pH, образуются между ведущими и замыкающими ионами. Скорость, с которой перемещаются зоны белка, и распределение концентраций ионов между их границами определяются концентрацией ведущих ионов. Объясняется это следующим скорость, с которой мигрирует замыкающий ион, зависит от скорости миграции ведущего иона, т. е. ион с самой малой собственной подвижностью перемещается с такой же скоростью, как и ион с самой высокой подвижностью, вследствие увеличения градиента напряжения в направлении, обратном направлению миграции. Внутри стопки белки концентрируются в узких зо нах, так как концентрация ионов на каждой стороне движущейся границы фиксирована согласно принципу Кольрауша [65]. Разделение зон белка достигается при помощи разделителей ( спейсеров ), т. е. веществ, ионы которых обладают промежу- [c.120]

Число фракций, на которые разделяется исходный белок при зональном электрофорезе, можно увеличить не только с помощью специальных методов окрашивания. Простая замена буферного раствора или поддерживающей среды дает тот же эффект. Например, при электрофорезе сыворотки на бумаге в буферном растворе трис-ЭДТА получается не пять, а девять белковых фракций [1 ]. Еще лучшее разделение можно получить в поддерживающей среде, которая обладает эффектом молекулярного сита, например в крахмальном или полиакриламидном гелях. Малые размеры пор этих гелей задерживают миграцию высокомолекулярных белков, так как трение при этом увеличивается настолько, что даже большой электростатический заряд их молекул не может компенсировать замедляющего действия поддерживающей среды. Однако в других поддерживающих средах величина белковой молекулы мало влияет на скорость миграции, поскольку эффект увеличения трения обычно компенсируется ее большим электростатическим зарядом. [c.11]

Топологическое распределение лнпндов тесно связано с их межмембранным обменом, а также с трансмембранной миграцией. В модели Синджера — Николсона подрвзумепается. что асимметричное распределение лнпндов сохраняется, поскольку молекулы липидов чрезвычайно медленно переходят с одной стороны мембраны на другую. Однако исследования последних лет показали, что скорость флип-флопа в биологических мембранах может быть очень велика (полупериод — 1—2 мин), причем это ускорение вызывается действием некоторых интегральных мембранных белков. [c.586]

Следует привести еще несколько примеров успешного применения гель-фильтрации в тонком слое. Линк [36] показал, что фракционирование в тонком слое можно проводить в присутствии 8М мочевины или 6,5 М хлоргидрата гуанидина. В этих условиях он сопоставил скорости миграции нативного и модифицированного (восстановленного и алкилированного) р-белка из спинномозговой жидкости. Совпадение скорост-ей миграции обоих образцов указывало на отсутствие в белке субъединиц с различным молекулярным весом. В сочетании с электрофорезом тонкослойную гель-фильтрацию применяли как удоб1у>1й метод контроля при выделении аминоацил-т-РНК-синтетаз [37]. При сопоставлении результатов анализа путем тонкослойной гель-фильтрации на G-200 двух фракций с валил-т-РНК-синтетазной активностью, но несколько различавшихся в функциональном отношении, оказалось, что обе фракции довольно близки по размерам молекул [38]. Радола [67] использовал тонкослойную гель-фильтрацию для решения ряда задач к ним относится анализ сывороточных белков животных и человека, растворимых белков культуры клеток млекопитающих in vitro, растворимых белков из листьев шпината. [c.266]

Поскольку размеры молекул белкового адсорбата в исследованных системах сопоставимы с размерами мезопор (так, молекула сывороточного альбумина представляет собой в растворе эллипсоид вращения с размерами 14,0x4,0x4,0 нм), то в этом1 случае, по-видимому, нельзя говорить о миграции молекул адсорбата в адсорбционном слое основным фактором, определяющим скорость адсорбции молекул с большой молекулярной массой в мезопористых сорбентах, является диффузия растворенных молекул в порах. На скорость адсорбции влияют также pH раствора, наличие полярных групп на поверхности адсорбента. При увеличении количества кислотных групп (окисленный уголь СКН) адсорбция замедляется и максимальная величина адсорбции также снижается. При pH раствора, близком к изоэлектрической точке белка, величина адсорбции максимальна. Приведенные закономерности свидетельствуют о преобладающем вкладе дисперсионных сил в адсорбцию белков на углеродных сорбентах. [c.142]

Как будет показано ниже (см. гл. ХХУП), характер распространения и тушения возбуждения в фотосинтетической светособираюш ей матрице в ряде случаев суш е-ственно зависит от температуры. Как правило, в биологических объектах характер влияния температуры на процесс миграции энергии, в основном, определяется зависимостью конформационного состояния белкового носителя от температуры. С температурой меняется расстояние и взаимная ориентация фиксированных на белке хромофорных групп, которые непосредственно передают энергию возбуждения (молекулы хлорофилла в фотосинтетической мембране, ароматических аминокислот в белке). При этом происходит изменение характера (энергии) взаимодействия хромофорных групп. С температурой меняется и характер релаксационного процесса в белке, который непосредственно влияет на соотношение скоростей колебательной релаксации и миграции энергии электронного возбуждения. Эти факторы в совокупности могут менять также и самый механизм миграции электронного возбуждения. [c.407]

Рис. 5-61. Два типа миграции ветвей наблюдаемые в эксперимеитах ш vitro. Спонтанно миграция идет в обоих направлениях, подчиняясь закону случая, поэтому реальное перемещение при этом очень невелико Миграция же с участием белка гесА идет с постоянной скоростью только в одном направлении, энергию для нее, очевидно, поставляет процесс поляризованной сборки белка гесА на одиночной цени ДНК, идущий в указанном

A. Различия в скоростях миграции вирусных белков при ПААГЭ 114 Б. Триптическое пептидное картирование. ..... 115 [c.7]

При анализе белков различных штаммов вируса гриппа методом ПААГЭ обнаруживаются заметные различия в скоростях миграции соответствуюпщх белков. Эти вариации происходят вследствие различий в молекулярной массе, заряде или (для гликопротеидов) числе и типе олигосахаридных боковых цепей. Выявленные различия в скоростях миграции соответствующих белков позволяют установить происхождение белков в рекомбинантных вирусах. Эта информация в сочетании с анализом РНК рекомбинантов была использована для построения генетической карты вирусов гриппа (для обзора см. [89]). Подробный анализ результатов сравнения различных белков подтипов вируса гриппа типа А птиц был опубликован F. Bos h и соавт. [16]. [c.114]

Помимо наличия ts-свойства, биохимические опыты с еа-виру-сом А/Апп Arbor/6/60 выявили, что каждый сегмент содержит мутации относительно вируса дикого типа [44]. Однако фенотипический анализ са-вируса в процессе заражения клеток MD K или клеток фибробласта куриного эмбриона при 39 °С показал отсутствие дефекта по сравнению с вирусом дикого типа, за исключением более медленной скорости миграции белка Р2 [44]. Было решено, что са-мутации действуют на поздние реиликационные функции [119]. [c.234]

НП оказывают глубокое воздействие и на другие уровни метаболизма клеток-мишеней. Установлены разнообразные их влияния на синтез РНК и белков. Рассматривая эти данные, следует учитывать несколько возможных механизмов. Во-первых, объектом фосфорилирования протеинкиназами, включаемыми при посредстве НП, могут бьггь белки-регуляторы трансляции и транскрипции. Во-вторых, значительные изменения содержания Са " ", да и других ионов, миграция которых возникает в результате модификации мембранных белков, Moiyr порождать другие процессы, ведущие в конечном счете к изменению скорости транскрипции тех или иных генов или к изменениям скорости трансляции (менее специфичным). В-третьих, наконец, заслуживает особого внимания установленное недавно явление интернализации рецептор-лигандных комплексов и сведения о наличии в оболочке ядра и в хроматине соединений, способных специфически связывать НП. Сама по себе интернализация комплекса лиганд-рецептор рассматривалась ра- [c.330]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология