Кумасси яркий синий

Если при разделении получается небольшое количество полос, то вполне достаточно, чтобы проба содержала от 5 до 50 мкг белка на 1 гель полоса, содержащая 1 мкг белка, хорошо видна после окрашивания кумасси ярким синим. Необходимо следить за тем, чтобы часть образца не перешла в электродный буфер. [c.267]

После электрофореза белковые зоны окрашивают кумасси ярким синим R-250 [367] или амидовым черным 10 В [964]. [c.224]

Кумасси яркий синий можно применять для окрашивания электрофореграмм, полученных не только на пленках из ацетата целлюлозы, но и на других поддерживающих средах, таких, как фильтровальная бумага, агаровый и крахмальный гели [367] или полиакриламидный гель, [867]. К настоящему времени описано большое число, различных методов окрашивания белков этим реагентом после их электрофореза в полиакриламидном геле. [c.268]

Малик и Берри [805] использовали реактив для фиксации и окрашивания белков, приготовленный на основе химически модифицированного кумасси яркого синего. 100 мл 2%-ного раствора кумасси яркого синего R-250 смешивают с равным объемом 2 н. серной кислоты и дают отстояться образовавшемуся осадку. К надосадочной жидкости по капля1м приливают 10 н. NaOH до появления голубоватого оттенка и, наконец, добавляют ТХУ до конеч ной концентрации 12 г/100 мл. Хроматографический анализ показал, что образовавшийся краситель отличается от исходного. В гелях, помещенных в полученный раствор, белковые фракции становятся видимыми через 15 мин в течение следующих 15 мин интенсивность окраски возрастает и затем уже не изменяется на протяжении 24 ч. Поэтому для окрашивания гелей данным методом установлено стандартное время — 30 мин, после чего гели переносят в воду, где они и хранятся. Если фон начинает окрашиваться, то достаточно поместить гели на короткое время в 0,2%-ную серную кислоту, чтобы эта окраска исчезла. Однако такую обработку следует [c.156]

Для выявления малых количеств антигена следует применять сильно разведенные антисыворотки. Однако при слишком сильном разведении образуются очень бледные преципитаты, которые трудно обнаружить. Чувствительность реакции преципитации можно повысить, если применять более чувствительные красители для белка, такие, как кумасси яркий синий. Можно использовать также реакцию с серебром [671]. Описанные в литературе способы выявления антигенов основаны на иммунохимических и физико-химических принципах. Кроме того, приме- [c.263]

Кумасси яркий синий растворяют также в смеси метанол — уксусная кислота — вода (5 1 5 ли 1 1 8 по объему). Для обесцвечивания фона используют тот же растворитель [107]. [c.269]

Окрашивание и обесцвечивание. Гели опускают в небольшие пробирки с окрашивающим раствором. Раствор готовят из 1,25 г красителя кумасси ярко синего в смеси 454 мл 50%-ного метанола и 46 мл ледяной уксусной кислоты с последующим от-фильтровыванием нерастворившегося материала через ватман № 1. Окрашивание длится 2—10 ч при комнатной температуре. Затем гель удаляют из окрашивающего раствора, споласкивают дистиллированной водой и помещают в раствор для удаления избытка краски (обесцвечивания), состоящий из 75 мл ледяной уксусной кислоты, 50 мл метанола и 875 мл воды, не менее чем на полчаса. Далее гель обесцвечивают электрофоретически в том же аппарате в течение 2 ч, используя раствор для обесцвечивания. Длина геля после обесцвечивания, а также положения зон белков, окрашенных в синий цвет, измеряются. Гели хранят в 7,5%-ной уксусной кислоте. [c.423]

Кумасси яркий синий не проявляет строгой специфичности по отношению к белкам. Б определенных условиях он может окрашивать также фосфолипиды, [196]. [c.271]

Рис. 96. л. Двухмерный электрофорез ядерных белков нормальной печени [943]. Электрофорез в первом направлении проводили в цилиндрических гелях, содержавших 10%-ный акриламид и 6 М мочевину, а во втором— на пластине геля, содержавшего 12%-ный акриламид и 0,1%-ный ДСН. Белки окрашивали кумасси ярким синим. Цифрами указаны зоны, отличающиеся по интенсивности окраски от тех же зон на электрофореграмме белков гепатомы Новикова. Б. Схематическое изображение электрофореграммы, представленной на рис. 96, А. Черные пятна обозначают наиболее интенсивно окрашенные зоны, заштрихованные —менее интенсивно окрашенные, светлые кружки —очень слабо окрашенные зоны, а пунктирные кружки — минорные компоненты. [c.308]

Для обнаружения рибосомных белков после электрофореза можно использовать любой применяемый после электрофореза в геле метод выявления белков (например, окрашивание амидовым черным 10 В, кумасси ярким синим К-250 или 0-250, а в случае радиоактивных белков -радиоавтографию). Недавно [c.314]

После фокусирования иммуноглобулины обычно выявляют путем окрашивания кумасси ярко-синим или бромфеноловым синим. [c.125]

Гели окрашивают по методу Фейербенкса и др. [2]. При слабом покачивании гели вымачивают по 1 ч в каждом из следующих растворов 1) 525 мл 95%-ного изопропанола, 200 мл ледяной уксусной кислоты, 1,0 г кумасси ярко-синего и 1275 мл воды 2) 210 мл 95%-но-го изопропанола, 200 мл ледяной уксусной кислоты, [c.158]

Окрашивание. В большинстве случаев перед анализом гели окрашивают. При разделении белков обычно применяют амидовый черный 10В, процион яркий синий RS и кумасси яркий синий R250 (последний обладает особенно большой чувствительностью). В продаже имеется много других красителей [66] для белков, дезокси-рибо- и рибонуклеиновых кислот. В литературе можно [c.268]

Приготовление раствора красителя для белков. К 1 части 0,2%-ного водного раствора (вес/объем) кумасси яркого синего G250 добавляют 1 часть 2 н. H2SO4 и оставляют на 3 ч. Осадок удаляют фильтрованием через хроматографическую бумагу Whatman № 1 и к раствору добавляют 7э объема 10 н. КОН. Затем приливают 100%-ную ТХУ до конечной концентрации 12% (вес/ /объем). [c.269]

Гели извлекают и окрашивают одним из принятых, способов. Например, по методике Грэсслина и др. [73],. гели окрашивают при осторожном перемешивании в течение 30—60 мин в 0,2%-ном растворе кумасси яркого синего 0-250 в смеси этанол — вода — ледяная уксусная кислота (45 50 5, объем/объем). Для обесцвечивания гелей их обрабатывают тремя порциями смеси этанол — вода — ледяная уксусная кислота (40 55 5) в течение 2 ч. [c.277]

Райзнер и др. [1073] разработали очень простую и быструю методику окрашивания, не требующую обесцвечивания фона. Она основана на том, что кумаоси яркий синий 0-250 изменяет свой цвет в разбавленной хлорной кислоте и вновь приобретает исходную окраску при связывании с белками. Для приготовления окрашивающего раствора указанный краситель (конечная концентрация 0,04%) добавляют к 3,5%-ной хлорной кислоте, и эту омесь перемешивают при комнатной температуре в течение 1 ч. Полученный раствор фильтруют сначала через фильтровальную бумагу ватман № 1, а затем через миллипоровый фильтр с размером отверстий 0,45 мкм. Реактив сохраняется при ком натной температуре неограниченно долго. Гели инкубируют в нем 2 ч при 37 °С или 4 ч при комнатной температуре, после чего их хранят в пробирках, заполненных 0,04%-ны М pa твiapoм кумасси яркого синего 0-250 в 2,5%-ной хлорной кислоте. Данный реактив позволяет избирательно выявлять гистоны с высоким содержанием аргинина, так как гистоны,. богатые лизином, растворяются в хлорной кислоте. [c.157]

Предложен быстрый способ выявления белка в геле при условии, что на одну полосу приходится более 5 мкг белка [1092]. Гели выдерживают 30 мин при 25 °С в 0,1%-ном растворе малахитового зеленого в смеси, состоящей из 25% этанола, 10% уксусной кислоты и 65% воды. Обесцвечивание производят с помощью поперечного электрофореза в водном растворе, содержащем 10% этанола и 10% уксусной кислоты. Для повышения интенсивности окраски полос прибегают к повторной обработке гелей 0,01%-ньгм раствором кумасси яркого синего, не приводящей к усилению окраски фона. [c.157]

В 1963 г. Фазекас де Грот и др. [367] предложили использовать для окрашивания белков после электрофореза на ацёта-те целлюлозы трифенилметановый краситель — кумасси яркий синий К-250 (синонимы кислый голубой 83, супранолцианин 6В экстра, С. I. 42660). С тех пор этот краситель широко используется во многих видах электрофоретического разделения. Молекула кумасси яркого синего К-250 содержит две группы ЗОзН и в слабо кислой среде- связывается с основными группами белков. В связывании принимают участие и вандерваальсовы силы. Белок и краситель образуют прочный комплекс, который, однако, полностью диссоциирует в результате разбавления раствора при соотйетствующнх значениях pH [367]. [c.268]

Поскольку кумасси яркий синий, растворенный в метаноле, в равной степени окрашивает белки и ацетат целлюлозы, было предложено использовать его водный раствор по следующей методике 1[367]. Белки фиксируют, погружая электрофореграммы на 1 мин в водный раствор сульфосалициловой кислоты (200 г/л). Затем их без промывания переносят на 5 мин в раствор кумасси яркого синего (2,5 на 1 л дистиллированной воды). Следует применять воду, свободную от тяжелых металлов, так как они мешают удалению красителя, связанного с ацетатом целлюлозы. Для обесцвечивания фона электрофореграммы четыре раза по 5 мин промывают дистиллированной водой. [c.268]

Различные белки окрашиваются кумасси ярким синим К-250 почти в одинаковой степени. Площади пиков на денситограмме находятся в линейной зависимости от количества нанесенного белка в сравнительно широком его диапазоне (вплоть до 10 мкг белка, нанесенного на полоску пленки шириной 1 см). Таким образом, метод вполне пригоден для количественного анализа разделенных белков. [c.268]

Крамбах и др. [234] использовали коллоидный раствор кумасси яркого синего в 12,5%-ной ТХУ. Поскольку этот краситель имеет низкую растворимость в 12,5%-ной ТХУ, его растворяют в воде и перед употреблением смешивают с раствором ТХУ так, чтобы получились нужные концентрации. После фиксации белков в 12,5%-ном растворе ТХУ гели погружают на 30—60 мин в раствор, содержащий 0,02—0,05% кумасси яркого синего К-250. Обесцвечивание проводить не обязательно, так как коллоидные частицы красителя не проникают в гель. Если окрашенный фон все же появляется, то его устраняют путем вымачивания геля в 7%-ной уксусной кислоте. Для фиксации белков, разделенных в присутствии мочевины, можно использовать раствор, содержащий 5% ТХУ и 5% сульфосалициловой кислоты. Быстрый метод фиксации и окрашивания белков кумасси ярким синим предложили Маурер и Аллен [840]. Гели фиксируют в течение 30 мин при 65 "С в 0,2%-ном растворе кумасси яркого синего в смеси вода — абсолютный спирт —уксусная кислота (45 45 10 по объему). Пластины геля, находящиеся в кювете с красителем, следует через каждые 10 мин переворачивать. (Этот метод можно использовать и для окрашивания белков после ИЭФ.) [c.269]

Гликопротеиды можно выявить путем окрашивания как белковой, так и углеводной части молекулы. Для обнаружения гликопротеидов после электрофореза используют такие белковые красители, как амидовый черный 10 В i[473], быстрый зеленый 883] или кумасси яркий синий R-250 [839]. Методы, основанные на реакциях углеводной части молекулы, обсуждаются в последующих разделах. [c.277]

Фишбейн [383] установил, что в водных растворах кумасси яркий синий постепенно разлагается с образованием смолистого остатка. Этот процесс ускоряется под действием ТХУ и замедляется в присутствии этанола. Фишбейн рекомендует использовать 1%-ный раствор красителя в абсолютном этаноле, разведенный в 20 раз 12,5%-ной ТХУ. Окрашивание проводят в течение 12 ч, после чего гели споласкивают метанолом и водой, а затем помещают в 12,5%-ный раствор ТХУ. Увеличение времени окрашивания свыше 12 ч не приводит к повышению интенсивности окраски. При использовании этого метода для анализа уреазы минимальное измеримое количество фермента составляло 0,2—0,3 мкг. Верхний предел количества белка, лежащий в линейной области денситограммы, зависит также от длины пути, пройденного этим белком при электрофорезе. С увеличением длины пути увеличивается и то максимальное количество белка, при котором еще сохраняется линейная зависимость. Например, если зона уреазы проходила 9 см, то линейная зависимость между количеством нанесенного белка и площадью пика при денситометрии сохранялась в диапазоне 1—55 мкг, а при перемещении той же зоны только на 2 см верхний предел этого Диапазона составлял 12 мкг белка. [c.269]

Другой способ количественного определения белков основан нэ элюции красителя из белковых зон после окрашивания и обесцвгечивания электрофореграмм в стандартных условиях. Феннер и др. [374] рашивали гели 0,5%-ным раствором кумасси яркого синего R-250 в 50%-ном водном метаноле, содержавшем 7,5% уксусной кислоты, по методу, который предложили Бикл и Траут [119]. После обесцвечивания фона окрашенные зоны вырезали и краситель экстрагировали из кусочков геля 25%-ным водный пиридином (объем/объем), встряхивая их при комнатной температуре до тех пор, пока не наступало равновесие, что определяли путем повторных измерений поглощения раствора. Пиридин смещает максимум поглощения красителя с 550 до 605 нм, поэтому измерение поглощения проводили при 605 нм. Этот метод позволяет определять белки в пределах 1 — 100 мкг. Он особенно полезен при двухмерном электрофорезе на пластинах геля, поскольку их сканирование представляет в настоящее время определенные технические трудности. [c.270]

Кумасси яркий синий G-250 (ксилоловый яркий цианин G, С. I. 42 665) по своей структуре сходен с кумасси ярким синим R-250, но содержит две дополнительные метильные группы. Ди-зел и др., [302] предложили использовать его для окрашивания белков в полиакриламидном геле. Гели погружают на 5 мин в. 12,5%-ную ТХУ, затем к 40 мл этого фиксатора добавляют 2 мл 0,25 уЬ-ного (масса/объем) водного раствора кумасси яркого синего G-250 и тщательно все перемешивают. С помощью данного метода белковые полосы хорошо прокрашиваются, и уже через 30 мин после электрофореза электрофореграммы можно фотографировать, не проводя их обесцвечивания, поскольку этот краситель еще менее, чем R-250, растворим в воде и почти не проникает в гель. При хранении гелей в 5%-ной уксусной кислоте интенсивность окраски белковых зон значительно увеличивается, по всей вероятности, вследствие диффузии красителя внутрь белковой зоны. Гели можно хранить в течение 8—10 нед без существенного снижения интенсивности окраски. [c.270]

Очень простую методику окрашивания белков с помощьк> кумасси яркого синего G-250 описали Рейзнер и др. [1073J. Для приготовления красящего раствора водный раствор красителя и хлорную ишслоту смешивают между собой до их кояеч- [c.270]

Пептидил-тРНК тоже можно обнаруживать на электрофореграммах с помощью красителей, специфичных для белков, таких, например, как кумасси яркий синий [1016]. [c.386]

После окончания электрофореза камеру с гелем извлекают из аппарата. Плексигласовые прокладки удаляют, а стеклянные пластинки осторожно разъединяют шпателем под струей воды. Надо сделать так, чтобы гель соскользнул в большую чашку Петри (диаметром 20 см) с подогретым до 37°С окрашивающим раствором (0,25% кумасси ярко-синий в смеси метанол — уксусная кислота — дистиллированная вода 5 1 5). Во время окрашивания (45—60 мин) чашку медленно покачивают на платформе качалки, помещенной в термостат, при 37°С. Можно также использовать водяную баню с качалкой (New Brunswi k, Нью Брунсвик, США), содержащую такое количество подогретой до 37°С воды, чтобы чашка не плавала. [c.108]

Перед окрашиванием кумасси ярко-синим пластинки в течение нескольких часов отмывают от амфолинов 10%-ным раствором трихлоруксусной кислоты, затем их погружают на 1 ч в 0,25%-ный раствор красителя в смеси метанол — дистиллированная вода — уксусная кислота (5 5 1) обесцвечивание производят в растворе, содержащем 7,5% уксусной кислоты и 5% метанола (Awdeh et al., 1968). [c.125]

Основан на адсорбции красителя Кумасси ярко синий G-250. При связывании красителя с белком развивается ярко-синяя окраска (Bradford, 1976). Поглощение измеряют при 595 нм. [c.48]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология