Кумасси синий

ОПРЕДЕЛЕНИЕ С КУМАССИ СИНИМ [c.83]

Метод основан на связывании с белками одного из кислых красителей кумасси синего, выпускаемого в двух модификациях R-25Q и G-250. При связывании с белками спектр поглощения красителя меняется интенсивности окраски от концентрации белка в пробе и диапазоне 1—10 мкг/мл имеет линейную зависимость. [c.83]

Краситель кумасси синий для белков [c.376]

Широкое распространение в настоящее время получил так называемый зональный электрофорез — электрофорез на твердом носителе (на бумажных полосах, агаре, крахмале, акриламиде), пропитанном буферным раствором с нужным значением pH. Положение белков на бумаге или геле определяют путем фиксации и последующего окрашивания их тем или иным красителем (обычно бромфеноловым синим, ами-довым черным или кумасси синим). Количество белка в каждой фракции можно ориентировочно определять по интенсивности окраски связанного красителя. Такое определение не дает строго количественного соотношения белковых фракций, так как количество красителя, связываемого различными белками, неодинаково. [c.89]

Что же произойдет если смесь белков, растворенных в ДСН, подвергнуть электрофорезу в блоке полиакриламидного геля. Каждая молекула белка связывает значительное количество негативно заряженных молекул детергента, общий заряд которых превосходит общий заряд белка. По этой причине белок после того, как будет приложено напряжение, начнет двигаться в направлении положительного электрода. Белки одного размера ведут себя сходным образом, поскольку, во-первых, их природная структура полностью нарушена ДСН так, что их форма идентична, во-вторых, они связывают одинаковое количество ДСН и приобретают одинаковый негативный заряд. Крупные белки, обладающие большим зарядом, подвергаются действию значительных электрических сил, а также более существенном торможению. В обычных растворах эти эффекты, как правило, взаимно погашаются, но в порах полиакриламидного геля, действующего как молекулярное сито, большие белки тормозятся значительно сильнее, чем малые белки. Вследствие этого сложная смесь белков делится на ряд полос, расположенных в соответствии с их молекулярной массой. Окрасив гель красителем кумасси синим, можно выявить основные фракции полипептидов Минорные белки идентифицируют серебрением минимальное [c.215]

Белки выявляют, поместив гели в 0,05 %-й раствор кумасси синего в смеси этанол — уксусная кислота — вода (10 1 30). Этой же смесью производят отмывку избытка краски. Затем измеряют длину пробега каждого белка от линии старта с точностью до 0,1 мм. Эти данные сравнивают с калибровочной кривой (рис. 94), которая строится по данным, полученным на белках-стандартах (табл. 8). [c.261]

Расчеты количества белков, связанных с мембраной, на клетку и доли поверхности плазматической мембраны, занятой этими белками, важны для понимания структуры плазматической мембраны. Для белков плазматической мембраны эритроцитов это вычислить наиболее просто, поскольку эритроциты легко выделить из крови и в них не содержится внутренних мембран, которые могли бы служить помехой при расчетах. С этой целью выделяют плазматические мембраны, после чего белки, связанные с мембранами, разделяют методом электрофореза в полиакриламидном геле с ДСН, а затем окрашивают красителем Кумасси синим. Поскольку интенсивность окраски в первом приближении пропорциональна количеству белка в полосе, то можно количественно определить белки, как показано в табл. 6-3. [c.53]

Рассчитанное число молекул гликофорина на клетку является слишком низким (в 2,5 раза ниже, чем истинное), потому что 60% молекулярной массы гликофорина приходится на углеводную часть, которая не окрашивается белковым красителем Кумасси синим. [c.317]

Рис. 6-24. Картина, полученная при электрофорезе белков, входящих в состав мембраны эритроцитов человека, в присутствии ДСН. Окрашивание проводилось кумасси синим (А). Положение в геле некоторых белков (Б) полоса, соответствующая гликофорину, выделена цветом дпя облегчения ее идентификации вблизи полосы 3. Другие полосы в геле на рисунке опущены. Многочисленные углеводные остатки в гликофорине замедляют движение молекул этого белка настолько, что они движутся почти так же, как значительно более крупные молекулы полосы 3. (С любезного

В работах по изучению мембран эритроциты оказались наилучшим объектом исследований, поскольку они легко доступны и относительно просто устроены. Будучи лишены органелл, эритроциты имеют только одну мембрану-плазматическую. Путем осмотического лизиса можно получить тени эритроцитов, т.е. чистые плазматические мембраны, без цитоплазмы. На рис. 10.21 показаны результаты электрофоретического разделения белков такого мембранного препарата на полиакриламидном геле, содержащем ДСН. При окрашивании кумасси синим проявляется более десяти полос. Основные полосы пронумерованы и обозначаются как полосы 1,2, 3, 4.1, 4.2, 5 и 6 (рис. 10.21). При окрашивании йодной кислотой - реактивом Шиффа (PAS-реак-ция) выявляется несколько белковых фракций, богатых углеводами. Эти полосы обозначаются соответственно PAS-1, PAS-2, PAS-3 и PAS-4. [c.211]

ЭДТА. 10. Белковый препарат (лабораторная работа №31). 11. Акриламид. 12. Бисакриламид. 13. 10 %-й персульфат аммония. 14. 10 %-й тетраметилэтилендиамин (ТЭМЭД). 15. Трис-глициновый буфер. 16. Бромфеноловый синий. 17. 12 %-я ТХУ. 18. 20 %-я сульфосалициловая кислота. 19. Этанол. 20. Уксусная кислота. 21. Кумасси синий. [c.259]

Наиболее надежными и универсальными красителями для белков являются амидовый черный 10В [109] и кумасси синий [12]. Наибольшее распространение получил универсальный краситель Stains-al [15], который окрашивает рибонуклеиновую кислоту в голубовато-розовый цвет, дезоксирибонуклеиновые кислоты и белки — в красный, кислотные полисахариды— в синий. [c.307]

Обесцвечивание гелей после обнаружения зон кумасси синим происходит с достаточной скоростью в процессе диализа в 12,5%-НОЙ трихлоруксусной кислоте. Самым простым, но длительным способом удаления из геля избытка амидового черного 10В также является обычный диализ. Гели, имеющие форму [c.308]

Зоны окрашивают так же, как описано для дискретного электрофореза в полиакриламидном геле. Наиболее чувствительным является обнаружение с помощью кумасси синего R250 (Serva, Гейдельберг) 1,25 г этого красителя растворяют в 227 мл метанола и добавляют 46 мл уксусной кислоты. Раствор разбавляют водой до 500 мл и фильтруют. Гели высушивают в течение 2—12 ч. Обесцвечивание проводят в растворе, содержащем 50 мл метанола и 75 мл уксусной кислоты в 1000 мл воды, путем диализа или электрофореза (см. выше). [c.347]

При необходимости концентрацию белка можно определить в реакции Брэдфорда [7]. Раствор для определения готовят следующим образом 100 мг кумасси синего G-250 растворяют в I50 мл 95%-ного этанола и 100 мл 85%-ной (вес на объем) фосфорной кислоты, затем доводят до 1 л дистиллированной НгО. Раствор оставляют на ночь и затем фильтруют через фильтровальную бумагу Whatman № 1. [c.386]

Для проведения двойной иммунодиффузии агаровый гель наливают на предметные стекла, после застывания вырезают в нем лунки и заполняют их исследуемыми растворами антигена (Аг) и антител (Ат). Растворы диффундируют в гель, и на той линии, где происходит взаимодействие Аг и Ат (с перекрестным связыванием и осаждением иммунных комплексов), образуется линия (дуга) преципитации. Ее можно наблюдать визуально, если промыть гель (для удаления растворимых белков) и нанести на него краситель, выявляющий белки, например кумасси синий. Такой метод может быть использован для определения родства между антигенами (синие кружки) и в реакции с данными тест-антителами (желтый кружок). При этом возможны три основных типа результатов (цифры в синих кружках обозначают эпитопы антигена). В реакции (1) дуги преципитации, образованные антителами и двумя исследуемыми антигенами, сливаются это показывает, что антитела взаимодействуют с идентичными эпитопами на двух антигенах (эпитоп 1). Такой результат не означает полную идентичность самих антигенов, но только их идентичность в том смысле, что данные антитела не выявляют различий между ними. В реакции (2) антитела выявляют 3 разных антигена, которые образуют независимые дуги преципитации. В реакции (3) антигены имеют общий зпитоп 1, однако один из них несет еще эпитоп 2. [c.528]

Акриламйдный гель напоминает студепь в зависимости от концентрации ингредиентов он может быть рых.тым или плотным. Готовят цилиндрический гель и наносят с одного конца небольшую пробу белковой смеси. Через гель пропускают электрический ток, и белки, двигаясь в голе (медленно в плотном и быстро в рыхлом), распределяются в виде очень узких полос в зависимости от их размера и заряда Полоски белка можно окрасить красителями, специфически выявляющими белок два из них, наиболее часто употребляемые, называются амидовый черный и кумасси синий . После того как полоски локализованы и идентифицированы, гель можно раэ резать на кружочки, как колбасу, и измерить в них радиоактивность. [c.288]

Для окрашивания гель, находяшийся на стекле или подложке, помешают в краситель кумасси синий R примерно на 1 мин. Целесообразно использовать прозрачную кювету с подсветкой, чтобы наблюдать за развитием окраски. После окрашивания сливают краситель обратно во флакон и промывают пластину под струей воды. Помещают пластину в раствор для отмывания, чтобы устранить фоновое окрашивание, вновь промывают и высушивают. Гели на подложках Gelbond удобно хранить в альбоме. Стеклянные пластины с гелями хранят вертикально в стопках или в коробках, закрытых пленкой. [c.204]

Набор стандартных белков разделяют с помощью электрофореза в гелях различной пористости с содержанием поперечных сшивок 5 15%. Выявляют белок, окрашивая его кумасси синим или серебром, и определяют молекулярную массу, сравнивая подвижность белка и стандарта. Особенно широкое применение этот метод нашел при определении молекулярной массы протомера сначала осуществляют денатурацию олигомера (например, кипячением в детергенте в присутствии Р-меркап-тоэтанола), а затем проводят разделение в гелях, содержащих ионный детергент додецилсуль-фат натрия. [c.51]

Удобно использовать систему диск-электрофореза Лэммли [15]. Гели в виде пластин обладают преимуществами по сравнению о трубчатыми гелями, поскольку в пластине можно параллельно анализировать несколько образцов, что дает возможность с высокой точностью сравнивать степени очистки на разных стадиях. Для анализа белков альфавирусов подходит 10%-ный разделяющий гель в то же время эффективное разделение вирионных белков флавивирусов (для которых характерен широкий диапазон мол. масс) достигается в 8—20%-ном градиентном геле. В исследуемом образце (он должен содержать 10—50 мкг белка в объеме 30 мкл или менее) вирионы разрушают, добавляя 1/5 объема раствора, содержащего 10% ДДС-Na, 5% 2-меркаптоэтанола, 50% глицерина и 0,05% бромфенолового синего. Смесь прогревают 2 мин в кипящей водяной бане, охлаждают и наносят на гель в качестве контроля используют стандартный набор белков с известными мол. массами. Когда бромфеноловый синий дойдет до конца геля, электрофорез прекращают и гель окрашивают, инкубируя его 2 ч при постоянном перемешивании в растворе, содержащем 1% кумасси синего, 25% изопропанола и ЮО/о уксусной кислоты [c.104]

Этот метод [178, 179] стал в последнее время очень распространенным, поскольку он Отличается большей чувствительностью и не меньшей точностью, чем метод Лоури кроме того,, вся процедура не занимает много времени. Основная проблема чисто техническая красители собираются на стенках стеклянной посуды и в кюветах (а также на коже ), что делает их довольно неприятными реактивами. При растворении кумасси синего 0-250 в надхлорной кислоте он дает красно-коричневую окраску, но при связывании его с белком в том же растворе окраска становится синей. Метод заключается просто в добавлении образца белка к реактиву и измерении окраски при 595 нм. Рекомендуется использование одноразовых кювет, однако адсорбированный краситель можно быстро удалить, промыв кюветы разбавленным раствором додецилсульфата натрия. Образовавшаяся окраска в определенной степени зависит от состава белка, и поэтому для точного определения белков нужно построить калибровочную кривую, используя соответствующую смесь белков. [c.315]

Окрашивание производится с использованием красителя, растворенного в фиксаторе. Существует много различных методов для преодоления встречающихся здесь трудностей, связанных со скоростью окращивания ([132, 183—189] ссылками на эти работы отнюдь не исчерпывается вся литература по данному вопросу). В качестве красителей широко используются амидно-черный, нигрозин, кумасси синий 0-250 и кумасси синий К-250. Последний особенно часто применяется для окрашивания белков, хотя он хуже окрашивает некоторые кислые белки по сравнению с амидно-черным. Кумасси синий обычно проявляет более высокую чувствительность, чем другие красители. В некоторых методах (см., например, [189]) красители не применяются, а используется свойство додецилсульфата калия или натрия выпадать в осадок на холоду. В белковых полосах содержится меньше свободного детергента, чем в промежуточных участках геля, поэтому полосы кажутся более прозрачными по сравнению с молочно-белым фоном. Этим методом тложно быстро получить результаты после гель-электрофореза в присутствии ДСН, но он недостаточно чувствителен. Успешно использовалось также предварительное мечение белков флуо-рескамином [190]. В этом случае денатурированные белки можно наблюдать (в содержащем ДСН геле) в ходе электрофореза по их флуоресценции в ближней УФ-области спектра. [c.326]

Недавно был предложен псевдофотографический метод окрашивания белковых зон серебром, который обладает большей чувствительностью, чем окрашивание кумасси синим. Он состо-дт в том, что после фиксации белки в геле обрабатываются [c.326]

Рис. 10.21. Электрофоретическое разделение белков эритроцитарной мембраны на ДСН-полиакрил-амидном геле. Краситель кумасси синий. (Печатается с любезного разрешения д-ра V. МагсЬез .)

Справочник химика 21

Химия и химическая технология