Белки методы выявления

Рассмотрим теперь метод пептидных карт. Его первый этап состоит в разрыве дисульфидных связей, далее белок денатурируют и расщепляют ферментами, например трипсином или пепсином. В результате получается набор пептидов, размер и аминокислотный состав которых характерен для каждого отдельного белка. Смесь пептидов наносят на лист хроматографической бумаги и проводят в одном направлении хроматографию, а в другом — электрофорез. Пептиды локализуются в виде отдельных пятен, образуя характерную картину ( отпечатки пальцев ), Метод пептидных карт особенно полезен для выявления малых [c.167]

Установление химического типа белков (и только белков ) является для чисто химических методов принципиально неразрешимой задачей, так как белки не являются классическими объектами органической химии. Они обладают практически неограниченной химической потенцией, и их исключительность состоит не в особой склонности к тем или иным, вполне определенным и характерным только для них химическим реакциям, а, напротив, в их универсальности. Химическое поведение белков характеризуется необозримо широким спектром действия, несопоставимым по своему функциональному многообразию с действиями любого другого класса молекул живой и неживой природы или соединений, синтезированных человеком. Именно благодаря универсальным биохимическим свойствам белков назначение генетического аппарата любого живого организма сведено только к их синтезу. В органической химии аналитические методы основаны на эмпирическом тестировании реакций, на выявлении тех химических особенностей, которые присущи лишь данному типу молекул или атомных групп. Со времени Бутлерова считалось незыблемым, что такому условию удовлетворяют все синтезируемые соединения. Не явились исключением здесь и жиры, углеводы и нуклеиновые кислоты. Поэтому определение типов их молекулярного строения на чисто химической основе не встретило непреодолимых осложнений. Подчеркнем, что сказанное относится ко всем природным и синтетическим полимерам, в том числе и к ближайшим искусственным аналогам белков -полиаминокислотам. Таким образом, предпринятые после Фишера попытки решить с помощью органической химии структурную задачу белков не достигли и не могли достичь цели. История химии белка данного периода скорее свидетельствует об обратном - имевшее место увеличение количества химических данных о белках сопровождалось ростом неопределенности в понимании их химического строения. Изучение на такой основе белков не приближало, а, напротив, уводило в сторону от решения этой типичной по своей постановке для синтетической органической химии задачи. [c.65]

Чтобы снизить вероятность получения ошибочных результатов, мы советуем исследовать лизат, содержащий гибридные белки, с помощью вестерн-блот-анализа с использованием антител к -галактозидазе (рис. 5.3) —это позволяет детектировать все минорные продукты. Кроме того, все получаемые результаты необходимо сопоставить с анализом нуклеотидной последовательности клонированный ДНК. Для идентификации продуктов клонированных генов можно также использовать вторые антитела, специфичные к антигенным детерминантам, которыми предположительно должен обладать гибридный белок. Поскольку уровень экспрессии гибридных белков высок, мы рекомендуем использовать иммуноферментный метод выявления антигенов с помощью вестерн-блот-анализа (табл. 5.2) ввиду надежности и быстроты этого метода. [c.149]

Ввиду того что установление последовательности аминокислот белков представляет трудоемкую и сложную задачу, усилия были направлены на совершенствование современной методики и технических средств. Речь идет о методе выявления термочувствительных аллелей, который позволяет обнаруживать в среднем вдвое большую изменчивость [89]. Это относится также к методу двумерного электрофореза. [c.61]

К настоящему времени накоплен огромный материал по структуре комплексов фермент — субстрат. Роль отдельных групп в отборе субстрата или в каталитическом акте, гипотетически вытекающая из этих структур, сегодня во многих случаях подтверждается сайт-направленным мутагенезом, одним из важнейших методов выявления роли отдельных аминокислотных остатков в функционировании белка (см. 7.11). Это позволяет заменить определенный аминокислотный остаток, предположительно участвующий в узнавании или в каталитическом акте, на любой другой путем создания соответствующей мутации в гене, программирующем исследуемый фермент или апофермент. Сохранение или, наоборот, исчезновение каталитических свойств является доводом в пользу или против роли данного остатка в каталитическом процессе. Однако сегодня установлены структуры ничтожно малой части ферментов и апоферментов и можно думать, что дальнейшее накопление материала по этому вопросу послужит основой для новых интересных обобщений. [c.223]

Применение. В гистохимии в качестве компонента при выявлении белков методом сулема--бромфеноловый синий [Пирс, 706]. В газовой хроматографии в качестве стандартного образца для идентификации веществ и калибровки хроматографа, [c.80]

Более быстрым методом разделения пептидов энзиматического гидролизата является метод пептидных карт ( отпечатка пальцев , или фингерпринта ), сочетающий высоковольтный электрофорез и хроматографию на бумаге. С помощью этого метода возможно сопоставление пептидных смесей, получаемых при расщеплении различных белков, и выявление столь малых различий в аминокислотном составе отдельных пептидов, как замещение единичной аминокислоты какой-либо другой. Такие различия имеют большое значение при сравнительном изучении гомологичных белков различных видов растений и животных, а также прй определении генетических изменений в структуре белка, возникающих в результате точечной мутации. [c.81]

Природные субстраты протеаз также пригодны для выявления этих ферментов после электрофореза. Гели инкубируют с белками, а затем окрашивают и обесцвечивают обычными для белков методами. Бесцветные или слабо окрашенные полосы появляются в местах действия протеолитических ферментов. Во многих случаях применяют окрашенные белки, что позволяет избежать трудоемких процедур окрашивания и обесцвечивания. [c.303]

Для обнаружения рибосомных белков после электрофореза можно использовать любой применяемый после электрофореза в геле метод выявления белков (например, окрашивание амидовым черным 10 В, кумасси ярким синим К-250 или 0-250, а в случае радиоактивных белков -радиоавтографию). Недавно [c.314]

СПЕЦИФИЧЕСКИЕ ГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ БЕЛКОВ [c.67]

Л.2.1. МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ ОБЩЕГО БЕЛКА [c.68]

МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ БЕЛКОВ [c.84]

Двумерное разделение пептидов, наиример гидролизатов белков, на целлюлозных н силикагелевых пластинках, где в одном (чаш е первом) направлении используется электрофорез в тонком слое (ТСЭ) при кислом pH буфера, а во втором — распределительная ТСХ. Оно применяется как для целей идентификации и сопоставления родственных белков (например, для выявления мутационных или патологических изменений), так и в качестве препаративного метода для последуюш,его анализа аминокислотной последовательности в пептидах. [c.460]

Эти методы основаны на специфичности антител при выявлении на срезах тканей клеток локализации антигенного белка среди всех других белков. Для идентификации антител в местах их специфического связывания антитела метили флюоресцентны- [c.105]

Взаимодействия между липидами и белками в растительных продуктах отличаются большим разнообразием, обусловленным множеством участвующих в них липидов и белков, а также многочисленностью сырьевых материалов и соответствующих технологических процессов. Все более активное выявление и изучение этих взаимодействий предопределяется, с одной стороны, разработкой новых технологий получения белков и, с другой стороны, развитием и совершенствованием как по качеству, так и по количеству методов и оборудования для идентификации и определения содержания липидов и анализа их взаимодействий с белками. Знания в этой области быстро расширяются цель настоящей главы состоит не в исчерпывающем рассмотрении всего вопроса, а в том, чтобы дать примеры или характерные сведения, которые могли бы служить руководством для читателей, желающих глубже вникнуть в эту проблему. [c.284]

Скорость течения жидкости (скорость элюции) можно регулировать наклоном пластины (обычно в диапазоне 5—20°). Для проявления результатов фракционирования удобнее всего воспользоваться методом снятия реплики. На влажный гель на 1 мин кладут листок толстой фильтровальной бумаги ( Whatman 3 ММ ) и прижимают его стеклянной пластиной. За это время жидкость из пространства между гранулами переходит на бумагу, а вместе с ней — и макромолекулы, находившиеся в подвижной фазе каждой хроматографической зоны. Фильтровальную бумагу затем подсушивают и пятна на ней выявляют одним из многочисленных методов окраски белков или НК, путем регистрации ферментативной активности, радиоактивности, иммунными методами и т. д. Все эти методы выявления были подробно рассмотрены при описании электрофореза и иммуноэлектрофореза [Остерман, 1981, 1983]. [c.163]

Рис. 4-50. Анализ образнов белка методом электрофореза в ДСП-полиакриламидном геле. Па фотографии показан гель, использованный для выявления белков, присутствующих на последующих стадиях очистки фермента. Самая левая дорожка (дорожка 1) содержит сложную смесь белков исходного клеточного экстракта, каждая из последующих дорожек содержит белки, полученные после хроматографического фракционирования белковых образцов, анализированных на предыдущей дорожке (см. рис. 4-47). В лунку каждой дорожки на гель наносили одинаковое количество белка (10 мкг). Отдельные белки в норме проявляются в виде узких окрашенных полос полосы расширяются, если в них присутствует слишком много белка. (С любезного разрешения Tim

Недавно образование необменоспособных комплексов с Сг(1П) или с Со (III) было использовано в качестве метода выявления участков в белках и в других биополимерах, активно связывающихся с металлами " Двухвалентные ио- [c.506]

Проблема гомогенности белков в свое время решалась относительно просто с помощью традиционных методов анализа. Препарат считали гомогенным, если он не делился на фракции при электрофорезе или при ультрацентрифугировании. В настоящее время эти критерии гомогенности утратили свое значение. В нашем распоряжении появились более чувствительные методы исследования и стали обязательными более строгие показатели гомогенности. Ионообменная хроматография и электрофорез в геле являются сейчас наиболее чувствительными методами выявления так называемой микрогетерогенности белковых препаратов, какова бы ни была ее природа. Термин микрогетерогенность предложили Синг [82] в 1943 г. и Колвин с сотр. [6] в 1954 г. Из методов электрофореза в геле наиболее чувствительным для анализа микрогетерогенности белков оказался вертикальный диск-электрофорез. При использовании этого метода требуются весьма малые количества необходимого для исследования материала, с его помощью можно одновременно анализировать большое число образцов и к тому же он отличается высокой разрешающей способностью. Диск-электрофорезом можно обнаружить микрогетерогенность препарата даже в том случае, [c.31]

Применение. В гистохимии для метахроматического выявления амилоида [1, 2]. Окрашивание метиловым фиолетовым обычно считают е1аинственным Специфическим методом выявления амилоида и единственным методом, позво-ЛЯЮШ.ИМ отличить истинный амилоид от гиалнноподобных белков [Пирс, 257]. В ботанике для прижизненной окраски ядер растительных клеток [3] и в бак териологии для окраски микроорганизмов. [c.224]

Существует несколько методов выявления криптических различий между белками, не обнаруживаемых посредством обычного электрофореза. Один из этих методов, получтший название последовательного электрофореза, состоит в электрофоретической разгонке одних и тех же образцов в различных условиях, например с использованием различных буферов или различных концентраций геля (рис. 22.12). При другом методе образцы ткани или ферменты подвергаются действию высокой температуры или некоторых других денатурирующих агентов, например обрабатываются мочевиной. В результате один из двух электрофорети-чески неразличимых белков может денатурировать, а второй-остаться [c.97]

Гистохимическое выявление белков основано главным образом на наличии реакционноспособных групп в аминокислотах. При помощи гистохимических методов можно выявлять аминокислоты, включенные в структуру белка. Простые аминокислоты и низкомолекулярные белки вы-мьгоаются из ткани в процессе фиксации и заливки. Как это будет видно из дальнейшего рассмотрения, в настоящее время существуют гистохимические методы для выявления лишь части аминокислот. Эти методы не обеспечивают информации ни об аминокислотном составе и аминокислотной последовательности, ни о величине и пространственном расположении белковой молекулы. Для идентификации белка эти методы применимы лишь в том случае, когда выявляемые реакционноспособные группы присутствуют в высоких концентрациях и могут служить характерным признаком данного специфического белка. Так, для кератиноподобных структур характерны высокие концентрации дисульфидных групп. Для общего изучения белка можно рекомендовать методы выявления концевых амино- и карбоксильных групп. [c.67]

В табл. 20 представлены электронно-микроскопиче-ские методы выявления белков, позволяюпдае получать доступные интерпретации результаты. [c.83]

Ж. Радиоактивно меченные фрагменты ДНК можно использовать пр выявлении сайт-специфических ДНК-связывающих белков мето дом торможения в геле, при очистке белков методом аффиннс хроматографии ДНК и при отборе бактерий, экспрессирующв определенный белок. [c.128]

Так как эпителиальные клетки обладают высокоорганизованным, характерным цитоскелетом, их часто используют в качестве объекта при разработке новых методов выявления цитоскелетных структур. Интактные клетки PtK были исследованы методом высоковольтной электронной микроскопии с предварительным высушиванием в замороженном состоянии или замещением в замороженном состоянии. В целом замороженные клетки выглядели под микроскопом примерно так же, как и клетки, фиксированные обычными методами [103]. В обоих случаях были видны многочисленные микротрабекулы, которые формировали анастомозы, ветвились, контактировали в цитоплазме с разнообразными фибриллярными элементами, а также прикреплялись к различным органеллам. Картина оставалась достаточно сложной и после кратковременной экстракции клеток бриджем (прямые биохимические данные о полноте такой экстракции отсутствуют). Несколько менее сложная картина наблюдается в том случае, когда для предотвращения осмотического шока в экстрагирующий раствор вводят сахарозу [22]. В препаратах, полученных без сахарозы, от цитоскелета остаются в основном лишь голые филаменты, многие из которых до некоторой степени разрушены [104]. Другой путь состоит в том, чтобы фиксировать клетки смесью глутарового альдегида, таниновой кислоты и сапонина. Такая смесь, по-видимому, обеспечивает частичную экстракцию цитоплазматических белков во время фиксации и служит для цитоплазматических филаментов протравой, так что фибриллярные структуры становятся лучше видны даже на тонких срезах — преимущество, которое отчасти компенсирует неизбежное при таком способе обработки огрубление деталей структуры [105]. Трудность изучения филаментов на срезах ясно осознается при сравнении методик, включающих и не включающих освобождение образца от материала для заливки (рис. 3.6). Было предпринято несколько попыток выявить цитоскелетные [c.62]

Результаты этих экспериментов подтвердили правильность предложенного метода выявления белок-белкового взаимодействия. Следует отметить, что хотя активность комплекса, состоящего из двух химерных белков (см. рис. 12.34, в), была значительно ниже, чем у природного белка GAL4, тем не менее этого было достаточно для окрашивания колоний соответствующих двойных трансформантов в темно-синий цвет при наличии в среде Xgal. [c.327]

Наибольший интерес представляют кинетическое описание протяженных кривых ферментативной деградации полимеров и выявление соответствующих кинетических закономерностей. С этим вплотную связана проблема разработки методов оценки биополимеров с точки зрения их атакуемости ферментами, а также в отношении оценки перевариваемости белков протеазами [22—25]. Иэ немногочисленных количественных данных в литературе по ферментативной деградации биополимеров видно, что для них свойственно ингибирование низкомолекулярньши продуктами реакции (см. [22, 26—32]), При этом в большинстве случаев выводы об ингибировании продуктами были сделаны при кинетическом анализе так называемых полных кривых ферментативной деградации биополимера, или протяженных участков кинетических кривых, с помощью известных методов ферментативной кинетики (например, используя интегральную форму уравнения скорости, см. [21]). В ряде случаев не исключена возможность некоторого действия ингибирования продуктами так, в работе [33] выдвинуто и обосновано положение, что формально-кинетический анализ протяженных участков кинетических кривых ферментативной деградации полимеров практически неизбежно приводит к кажущимся эффектам ингибирования продуктами, даже если продукты не связываются с ферментом и ингибирование на самом деле отсутствует. Этот эффект наблюдается для ферментов, реакционная способность которых уменьшается при увеличении степени конверсии полимерного субстрата (за счет уменьшения степени полимеризации субстрата или доли наиболее реакционноспособных (доступных) связей в молекуле полимера). Подобные ферменты составляют подавляющее большинство ферментов-деполимераз (см. табл. 1). [c.30]

Определенные схемы и комбинации приемов анализа сложных структур (адекватные уровню развития вычислительной техники). Об этом, в частности, свидетельствует становление приемов структурного анализа в такой специфической области, как химия белков. Здесь широко используется паттерсоновский метод фиксации позиции тяжелых атомов, специально вводимых в белок, сравнение паттерсоновских распределений для ряда изострук-турных производных белка, выявление знаков (начальных фаз) структурных амплитуд путем статистической обработки данных о разности единичных амплитуд в изо-структурных парах (метод изоморфного замещения). На определенной стадии анализа привлекаются и априорные сведения о геометрическом строении отдельных группировок, входящих в состав белка [c.113]

Наличие изоферментов может быть обусловлено также генетическими вариациями в гетерозиготах. Так, если генетически детерминированный вариант определенного белка несет на один положительный или отрицательный заряд больше (или меньше), чем стандартный фермент, то при электрофорезе соответствующей белковой фракции у гете-розигот будет обнаружен новый изофермент. Следует отметить, что электрофоретический метод, часто используемый для выявления изоферментов, не позволяет обнаружить генетические варианты, в которых замещения аминокислот не приводят к изменению заряда молекулы. [c.68]

Кривая, представляюш,ая часть комплемента, связанную в первой реакции (разные количества антигена на то же количество антител и комплемента морской свинки), имеет форму колокола, максимум ее соответствует определенному соотношению антигена и антитела, называемому эквивалентностью. Указанный метод особенно чувствителен для выявления структурных различий белков [13, 92, 93 пример этого приведен на рисунке 4.7. Для данного метода необходимо, чтобы антисыворотка была моноспецифична, когда исследуются биологические растворы или экстракты, содержащие смесь белков. [c.104]